tlc板技術(shù)經(jīng)驗(yàn)交流

1、TLC薄層層析技術(shù),Thin-Layer Chromatography,2,一、 TLC簡(jiǎn)介 二、操作過(guò)程三、 擴(kuò)展及用途四、問(wèn)題討論,主要內(nèi)容：,背景：薄層色譜法(Thin-Layer Chromatography,簡(jiǎn)稱(chēng)TLC）是Kirchner等人在五十年代從經(jīng)典柱色譜法及紙色譜法的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái) 的一 種 色 譜技術(shù)。六 十年代后，Stahl等人 對(duì)薄層色譜法的標(biāo)準(zhǔn)化、規(guī)格化及擴(kuò)大應(yīng)用等方面進(jìn)行了許多工作，使該法日趨成

2、熟。2010年版中國(guó)藥典一部有3341項(xiàng)鑒別采用TLC法分類(lèi)：按薄層色譜使用的固定相的性質(zhì)及其分離機(jī)制可分為吸附薄層、分配薄層、離子交換薄層及分子排阻薄層,背景和分類(lèi),4,原理: 利用吸附劑(硅膠)對(duì)樣品中各組分 吸附能力 不同，及展開(kāi)劑對(duì)它們的解吸附能力 的不同，使各組分達(dá)到分離的目的。,特點(diǎn)：微量、快速、簡(jiǎn)單、節(jié)省,一般認(rèn)為T(mén)LC是一種定性和半定量的方法,原理和特點(diǎn),5,操作過(guò)程,氧化鋁

3、有弱堿性 pH=9、酸性pH=4及中性pH=7.5三種氧化鋁。弱堿性氧化鋁用來(lái)分離中性或堿性化合物；中性氧化鋁適用于酸性及對(duì)堿不穩(wěn)定的化合物的分離；酸性化合物可用酸性氧化鋁分離。硅藻土、纖維素、葡聚糖凝膠等化學(xué)鍵合固定相（C18、C8 等）,薄層板,硅膠 表面帶硅醇基（－Si－OH），呈弱酸性 (pH=4.5)，活性硅膠適合分離酸性或中性化合物，如酚類(lèi)、有機(jī)酸、醛類(lèi)、甾體化合物以及氨基酸類(lèi)，是基于吸附作用；非活

4、性硅膠含有一定的水，在分離色素時(shí)是基于分配作用。,硅膠G: 是含有13％煅石膏（gypsum）黏合劑的硅膠硅膠H：不含黏合劑的硅膠硅膠HF254：不含黏合劑，含有一種無(wú)機(jī)熒光劑（如錳激活的硅酸鋅），在254nm波長(zhǎng)紫外光下呈強(qiáng)烈黃綠色熒光硅膠GF254：含有煅石膏黏合劑，含熒光劑，在254nm波長(zhǎng)紫外光下呈強(qiáng)烈黃綠色熒光硅膠HF254+366：不含粘合劑，在254與366nm波長(zhǎng)有熒光硅膠PF254：制備型的，在254n

5、m有熒光（有熒光劑，適用于不發(fā)光不易顯色物質(zhì)的制備與分離）,市售預(yù)制板規(guī)格,將吸附劑或載體均勻涂布在玻璃板、塑料片或鋁箔上的預(yù)制板。薄層有軟板及硬板兩種。硬板系在吸附劑中加入適量粘合劑后用濕法涂層，粘合劑的加入可以增加薄層的強(qiáng)度。常用的粘合劑為羧甲基纖維素鈉(CMCNa)或煅石膏(CaSO41/2H2O)使用前一般應(yīng)于110℃下活化30min薄層厚度約為 0.2-0.3mm。 制備板0.5-2mm。,薄層的制備,手動(dòng)點(diǎn)

6、樣：靈活方便，常用于各種TLC鑒別中。自動(dòng)點(diǎn)樣 重現(xiàn)性和準(zhǔn)確性好，常用于薄層掃描法的含量測(cè)定。,半自動(dòng)點(diǎn)樣儀,點(diǎn)樣量：原點(diǎn)位置的負(fù)荷有限，體積0.5～10微升，濃度通常為0.5～2mg。直徑3mm以內(nèi)樣品溶劑：原則上應(yīng)選擇對(duì)可以溶解但溶解度不是很大的溶劑一定要有交叉點(diǎn),點(diǎn)樣,Spyringe,10,Note: a.點(diǎn)樣的濃度要控制適當(dāng)； b.點(diǎn)的斑點(diǎn)較小，展開(kāi)的TLC 分離度

7、好 c. 0.3mm 毛細(xì)點(diǎn)有機(jī)相， 0.5mm點(diǎn)水相。,毛細(xì)管取樣1cm？ 3.14*（0.3mm/2）²*10mm=1.413mm³=0.71μL 3.14*（0.5mm/2）²*10mm=3.925mm³=1.96μL,點(diǎn)樣常見(jiàn)問(wèn)題,1、點(diǎn)樣量太多。展開(kāi)劑不能全部負(fù)載2、太濃了。展開(kāi)劑從原點(diǎn)外圍繞行3、濃。未分開(kāi)4、樣品溶劑殘留。吹干時(shí)應(yīng)注

8、意高溫 破壞樣品5、點(diǎn)樣量太少?？床磺?、樣品溶劑中溶解度很大。原點(diǎn)將變 成空心圓,12,Note: a.產(chǎn)品在水相 or有機(jī)相； b.有無(wú)沒(méi)溶解的固體。,反應(yīng)液的取樣：,展開(kāi)方法 展開(kāi)劑浸入薄層下端高度不應(yīng)超過(guò) 0.5cm，當(dāng)心將樣品帶被展開(kāi)劑浸泡硬板可以進(jìn)行近水平、上行、下行、雙向、多次展開(kāi)等展開(kāi)槽有直立式、平臥式、雙槽式、夾心式或水平式,Note：

9、a.展開(kāi)槽應(yīng)密閉。溶劑蒸氣、液相( 展開(kāi)劑)、固定相 ( 吸附劑) 一起構(gòu)成復(fù)雜的三維層析過(guò)程b.展缸預(yù)先飽和以減弱邊緣效應(yīng)，如果薄層板也同時(shí)預(yù)飽和效果更佳。c.點(diǎn)樣帶寬時(shí)（常見(jiàn)制備板）。先用大極性溶劑展2cm以濃集樣品，干燥薄層板，再用所需展開(kāi)劑展開(kāi)。,使各成分間有較好的分離;Rf在0.2～0.8為有效;監(jiān)控點(diǎn)應(yīng)在0.4~0.6之間不與待測(cè)組分發(fā)生化學(xué)反應(yīng);沸點(diǎn)適中，黏度較??；展開(kāi)后組分斑點(diǎn)圓且集中；混合溶劑最好新鮮

10、配制;,展開(kāi)劑的選擇原則,16,展開(kāi)方向有單向、單向長(zhǎng)板、多次、多種極性展開(kāi)等.,展一次,展多次,第一次展開(kāi)PE/EA=4:1,第二次展開(kāi)CH2Cl2/MeOH=10:1,采用多次展開(kāi)的方法可以提高TLC的分離效果。做一次檢測(cè)得到較多的樣品信息，展開(kāi)前多思考。,17,展開(kāi)機(jī)理的探討,ABCD為硅膠層， EFCDG為展開(kāi)劑，EF為展開(kāi)劑前沿，CDG為展開(kāi)劑水平面。展開(kāi)劑以硅膠膠表面ED為界分,毛細(xì)層（EFCD）內(nèi)的展開(kāi)劑理所當(dāng)然向A

11、B方向運(yùn)動(dòng)依附層（EDG）的展開(kāi)劑作為額外的補(bǔ)充源泉 同一瞬間，跨過(guò)薄層板上任一點(diǎn)展開(kāi)劑的絕對(duì)量彼此相等，但由于液層厚度不同，必然存在速度差異所以，Rf 值越大 ，斑點(diǎn)也就越大。,堿性物質(zhì)能與硅膠作用，易被吸附出現(xiàn)脫尾，加TEA，NH3H2O，Pyridine等避免,先低后高，先單一后復(fù)雜，酸加酸，堿加堿，羰基加丙酮，相似相容原則,展開(kāi)劑的選擇方法,石油醚<二氯甲烷<乙醚<四氫呋喃<乙酸乙酯<丙

12、酮<正丙醇<甲醇<水,常用展開(kāi)劑極性順序,三角形法,（a）適于吸附薄層; (b) 適于分配薄層.,（a）,苯,點(diǎn)滴實(shí)驗(yàn)法,最合適的展開(kāi)劑？,Note：a.展開(kāi)劑渾濁不清，應(yīng)分液澄清后b.正丁醇和丙醇對(duì)斑點(diǎn)擴(kuò)散影響較小c.丙酮可混溶溶劑，降低劑粘度，加快展速d.由于混溶性和硅膠耐酸能力的限制，水和酸的使 用是有限度的。,大展開(kāi)劑: ArOH (aq sat.)、n-BuOH (aq

13、 sat.) 、nBuOH-AcOH-H2O(5:1:1)、iPrOH-NH4OH-H2O(10:5:1),常用展開(kāi)劑對(duì)：E/P、M/D、PE / Acetone、THF/PE、 MeOH/Toluene、DCM/PE,nBuOH/acetone/AcOH/H2OVB1及其磷酸酯,nPrOH/NH3H2O(con.)/H2O=20/20/1AMP單磷酸及3,5-雙磷酸,n-BOH/HOAc/

14、H2O=5/1/1巰基乙胺及甲基化后,DCM/MeOH/HOAc=10/1/0.05甘氨膽酸,THF/PE=2/3ED-71中間體,AsMg、FPM中間體硫醚，亞砜、砜,,,24,顯色,一看、首先在日光下觀察，劃出有色物質(zhì)的斑點(diǎn)位置二照、在紫外燈下觀察有無(wú)暗斑或熒光斑點(diǎn)三碘、多數(shù)有機(jī)物吸附碘可逆的產(chǎn)生棕色或黃色斑點(diǎn)四顯、既無(wú)色又無(wú)紫外吸收的物質(zhì)，可以用顯色劑顯色,,,DIEA,PE/EA=1:2,N

15、Et3,25,各種常用顯色劑及其配制方法:,,26,續(xù)表,,定性,影響Rf值的因素較多：溫度、濕度。一般在較高溫度下展開(kāi)時(shí)，Rf值較高，反之降低需經(jīng)過(guò)兩種以上不同組成的展開(kāi)劑得到的 R f值與標(biāo)準(zhǔn)品一致時(shí)，才可認(rèn)定該斑點(diǎn)與標(biāo)準(zhǔn)品是同一化合物；通過(guò)斑點(diǎn)顏色，有無(wú)紫外吸收或產(chǎn)生螢光的顏色，以及用專(zhuān)屬性顯色劑后斑點(diǎn)顯色的情況與標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照可幫助鑒定,手性薄層色譜,一、手性選擇劑混合制板（較難實(shí)現(xiàn)）二、手性選擇劑添至流動(dòng)相中，作展

16、開(kāi)劑使用三、？,好的分析方法應(yīng)該是簡(jiǎn)單的，簡(jiǎn)潔是一種美。,手性薄層色譜分離的因素,手性選擇劑的種類(lèi)、 純度、 濃度大小、 與吸附劑的比例,化合物消旋化， 配置成溶液后這種趨勢(shì)變得更大。,Nature 1965 208, p71 - 72,nBuOH/Pyridine/H2O=1/1/1L-isomerD-isomer,nBuOH/Pyridine/H2O=1/1/1L-isomerD-isomer,31,TLC用途,3

17、2,監(jiān)測(cè)反應(yīng)進(jìn)程:,反應(yīng)有無(wú)新點(diǎn)產(chǎn)生原料有無(wú)剩余，剩余多少反應(yīng)是否干凈綜合判斷反應(yīng)如何處理,,Note：點(diǎn)樣量 b.檢測(cè)時(shí)間c.留樣對(duì)照 d. 重要板留存,33,反應(yīng)物加完應(yīng)立即檢測(cè)；反應(yīng)中出現(xiàn)變化（溫度，顏色，氣體、沉淀）立即檢測(cè)反應(yīng)物加完后半小時(shí)內(nèi)應(yīng)檢測(cè)，然后適時(shí)跟蹤檢測(cè)快速反應(yīng)的體系（如硝化、還原），在短時(shí)間內(nèi)需要檢測(cè)過(guò)夜反應(yīng)，過(guò)夜前后應(yīng)檢測(cè),檢測(cè)時(shí)機(jī),34,極性增大:NO2?

18、NH2RNH- Bn (Boc, Cbz) ? RNH2X ?-NH、CNR-S-R’ ? R-SO-R’CHO（ R-X ）?CH2OH ?CO2H,官能團(tuán)轉(zhuǎn)化,極性相近的：R=R ??R-RCHO ??C=C,極性減小:OH?X (Cl, Br, I) COOH?CO2R ,R-SO-R’ ? R-SO2-R’-NH2(-OH) ? NH-R ,(OH- R ,),35,,TLC組合判斷,,TLC-HPLC/

19、LC-Ms聯(lián)用（定性和定量）TLC-MS聯(lián)用(適用于拿標(biāo)樣點(diǎn)）TLC-NMR聯(lián)用（確認(rèn)結(jié)構(gòu)）,,,,,,TLC,MS,,NMR,LCMs/HPLC,,36,后處理情況,,EA,,H2O,固體的純度和母液的取舍,,Solid,,Mother solution,萃取是否有效,37,摸索柱層析洗脫條件,Note: Rf值在0.2左右的展開(kāi)劑比例為洗脫劑的合適值 過(guò)柱時(shí)組分流出順序未必和TLC上點(diǎn)極性順序一致,,,,,,

20、,Desired product,,梯度洗脫,39,制備TLC,展 開(kāi),刮板,洗 脫,點(diǎn) 板,,,,顯 色,,40,制備TLC,Note: 1 溶劑: 極性小, 溶解性好，易揮發(fā) 2 上樣量: 40-60mg 3 上樣的位置: 距離兩端大約1cm, 距離底邊大約2cm.,Note: 上樣時(shí)如果上的色帶太寬或不齊 可用大極性溶劑預(yù)展開(kāi) 2~3 cm,4