具有群體感應抑制活性的海洋細菌的篩選與活性物質研究.pdf

1、細菌耐藥性問題日趨嚴重，傳統(tǒng)的抗菌藥物容易使病原菌產生抗藥性，要從根本上去除細菌的致病性還是要通過阻斷或改變其致病過程中必須的通路，使致病基因無法表達，這樣不僅消除了細菌的致病性，還確保了不會產生耐藥性問題。群體感應調節(jié)著細菌諸多生理功能，而大多數(shù)細菌的致病性亦受到細菌群體感應系統(tǒng)的調節(jié)，通過研究細菌的群體感應體系，建立科學的篩選模型，找到具有抑制細菌群體感應活性的天然產物，是開發(fā)新型抗菌物質的有效途徑。
　　 本論文以紫色桿菌

2、12472為報告菌，對從美國圣璜島海域海綿中分離出的272株細菌進行群體感應活性的篩選，獲得2株能有效抑制紫色桿菌12472群體感應活性的菌株66和108，通過16SrDNA分析，鑒定了兩株細菌的種屬，選取108為研究目標進行下一步實驗;然后對108號菌發(fā)酵條件和培養(yǎng)基組成作了優(yōu)化，通過活性測試確定其最佳發(fā)酵條件和培養(yǎng)基組成;采用優(yōu)化后的培養(yǎng)條件對菌株108進行擴大培養(yǎng)，活性物質的粗分離，用薄層層析法確定了活性物質的柱分離條件，對108

3、號菌的發(fā)酵產物進行反相減壓柱分離，通過高效液相色譜法、核磁共振波譜法和GC-MS質譜法鑒定了活性物質的化學組成，為天然產物作為群體感應抑制劑的研究提供了參考。主要結論如下:
　　 (1)運用濾紙片法，雙層軟瓊脂法和色素抑制法對分離自美國圣璜島海域海綿中的272株海洋細菌進行了群體感應抑制活性的篩選。結果表明，經過多次濾紙片法重復實驗，有17株菌群體感應活性較好，能有效抑制紫色桿菌12472群體感應活性，其中66，74，108，5

4、52等菌效果較好，抑制半徑始終在2mm左右;經過雙層軟瓊脂法實驗，證實有40株菌活性較好，其中大多數(shù)都是在濾紙片法中有較好活性的菌株;通過色素抑制法的篩選，發(fā)現(xiàn)108號菌株抑制效果最明顯，與空白對照相比較，抑制率達到20％左右。綜合各個方法篩選結果，選取66和108號菌株進行菌種鑒定，并對108號菌進行進一步實驗。
　　 (2)對初篩和復篩選出的兩株高活性菌株66和108進行16SrDNA分析，結果表明，66與表皮短桿菌（Bre

5、vibacterium epidermidisSW34）親緣關系最近，108與馬胃葡萄球菌(Staphylococcus equorum subsps)親緣關系最近。
　　 (3)通過單因子實驗，對活性菌108的發(fā)酵條件進行優(yōu)化。考察不同發(fā)酵時間、溫度、轉速、接種量、pH和培養(yǎng)基組成對菌株生長、代謝物產量、群體感應抑制活性的影響。結果表明:108號菌株最佳發(fā)酵條件為發(fā)酵時間36h，發(fā)酵溫度25℃，轉速120rpm，接種量5％，培

6、養(yǎng)基pH7;最佳培養(yǎng)基組成為蛋白胨15g/L，酵母膏5g/L，NaCl15g/L。
　　 (4)采用優(yōu)化的培養(yǎng)條件對菌株108進行規(guī)?；囵B(yǎng)，培養(yǎng)體積為45L，經乙酸乙酯-丙酮萃取后，得到粗提物2.9g。將108的發(fā)酵產物初步分成極性不同的三相:正己烷相、二氯甲烷相和甲醇水相，運用濾紙片法進行活性測試。結果顯示，活性組分主要集中于二氯甲烷相中。采用薄層層析法選擇分離108號菌活性產物的溶劑體系、溶劑比例及代謝物質大致的極性段。結

7、果表明，丙酮和石油醚體系適于108二氯甲烷相的分離。用反相減壓柱進行柱分離，分離條件為甲醇含量分別為10％、20％、40％、60％、95％和100％的梯度洗脫，對洗脫下的物質進行活性追蹤，發(fā)現(xiàn)60％甲醇水洗脫下的物質具有最強的群體感應抑制活性，在250μg/片的用量下，活性物質對紫色桿菌素的抑制圈半徑達到7mm。高效液相色譜面積歸一化法結果顯示，活性產物含量為15.962％。核磁共振波譜（混合氫譜）和GC-MS質譜初步分析結果，活性成分