新es胚胎干細胞

1、內(nèi) 容,個體發(fā)生過程干細胞的概念胚胎干細胞概念應(yīng)用前景面臨的問題及解決辦法,一 、個體發(fā)生過程 受精 卵裂 受精后72h 受精后5-7天精子+卵子 合子 卵裂球 桑椹胚 囊胚

2、 滋養(yǎng)層?胎盤及胎兒附屬結(jié)構(gòu)囊胚 內(nèi)胚層?消化道、呼吸道上皮和腺體；肝；膽；胰。 內(nèi)細胞群 中胚層?結(jié)締組織；血液；肌肉；骨骼；泌尿生殖系統(tǒng) 外胚層?體表結(jié)構(gòu)；神經(jīng)系統(tǒng),,,,,,,,,,,囊 胚,,,,,ICM,二、干細胞的概念,1、干細胞：具有自我復(fù)制的能力，在一定條件下

3、能分化成各種功能細胞。,2、分類,（1）全能干細胞，包括：胚胎干細胞（embryonic stem cells, ES細胞）生殖干細胞（embryonic germ cells, EG細胞） 具有全能性，能夠分化成所有細胞類型， 進一步形成機體的任何組織和器官。（2）多能干細胞：具有分化成多種細胞和組織的潛能，但卻失去了發(fā)育成完整個體的能力。（3）專能干細胞：只能向一種或密切相關(guān)的兩種類型的細胞分化。,,干細胞是一種能夠分裂

4、成與自身一致的細胞或幾種特殊分化的細胞型的細胞。動物體內(nèi)干細胞的正常作用是在發(fā)育的過程中可提供不同的細胞型,以生長成不同的組織和器官。它們也提供替代細胞以修復(fù)身體不同部分的損傷。,,干細胞療法就是利用已特殊分化的干細胞,通過特殊的途徑提供細胞去替代那些在退行性過程和損傷中失去的細胞。使用未分化干細胞也存在畸胎瘤和其他腫瘤形成的風(fēng)險。,,目前人干細胞的主要來源或者潛在來源如下: ①胚泡,可以提供多能干細胞; ②胎兒組

5、織,可以提供多能或者專能干細胞; ③臍帶血,可以提供專能干細胞; ④成人組織,可提供專能干細胞或單能干細胞。,三、胚胎干細胞,1、概念胚胎干細胞 (embryonic stem cells,ESC)是一種從早期胚胎內(nèi)細胞團或原始生殖細胞經(jīng)分離、體外培養(yǎng)、克隆等得到的具有發(fā)育全能性的細胞。ES細胞可不斷保持增殖而不分化且在連續(xù)培養(yǎng)后仍能具有發(fā)育成三個胚層的潛能。 這種細胞具有與早期胚胎相似的分化潛能和正常二倍體核型

6、，因此兼有早期胚胎卵裂球及體細胞的某些特性。,,ES細胞的全能性（totipotenty），是指ES細胞在解除分化抑制的條件下能參與包括生殖腺在內(nèi)的各種組織的發(fā)育潛力，即ES細胞發(fā)育成完整動物體的能力。其實質(zhì)是細胞基因組中決定蛋白質(zhì)編碼的所有基因按一定的時空順序依次表達。ES細胞是能在體外大量增殖的全能性細胞，可以為細胞的遺傳操作和細胞分化研究提供豐富的實驗材料。,,ES細胞全能性的檢測方法是以胚胎干細胞進行細胞核移植。如果ES細胞能

7、和去核的細胞融合發(fā)育成重構(gòu)胚，而且經(jīng)過胚胎移植，重構(gòu)胚能發(fā)育形成個體，則表明ES細胞具有全能性。例如，將綿羊的類ES細胞注射到去核卵母細胞中，獲得重構(gòu)胚。重構(gòu)胚經(jīng)過胚胎移植，有活的羔羊產(chǎn)生，證明了綿羊的類ES細胞具有發(fā)育全能性。,2、ES細胞研究發(fā)展史,1981年，英國劍橋大學(xué)的Evans和Kaufman用囊胚內(nèi)細胞團(ICM)建立小鼠ES細胞系1998年美國Thomson從人的體外受精囊胚中分離得到了ES細胞。同年約翰霍普金斯大學(xué)

8、的Shamblott等從人的PGC細胞中分離得到人的全能性干細胞。人ES細胞的分離成功給人類的基因治療和器官移植打下了基礎(chǔ)。其他動物只獲得了類ES細胞。,1999年12月，美國《科學(xué)》雜志公布了當(dāng)年世界科學(xué)進展的評定結(jié)果，干細胞的研究成果列在舉世矚目耗資巨大的人類基因組工程之前，名列十大科學(xué)進展首位。2002年3月，美國麻省理工學(xué)院的科學(xué)家宣布，他們首次利用人體胚胎干細胞培育出毛細血管，證明了胚胎干細胞技術(shù)在治療心血管疾病等領(lǐng)域的

9、應(yīng)用潛力。目前已有報導(dǎo)ES細胞能在適當(dāng)條件下分化為心肌細胞，胰島細胞，血管內(nèi)皮細胞，肝細胞等。,衍生自囊胚的內(nèi)細胞團或原始外胚層的細胞；永生化(immortal)；能維持穩(wěn)定的正常的二倍體染色體結(jié)構(gòu)；有穩(wěn)定的發(fā)育潛能，能被誘導(dǎo)增殖或分化；能參與胎兒所有組織的發(fā)育過程；,3、胚胎干細胞的性質(zhì),4、胚胎干細胞系的建立過程,4.1 概述,4.2 胚胎干細胞的分離酶消化后培養(yǎng)免疫方法去處滋養(yǎng)層細胞流式細胞儀分離法,4.3 培

10、養(yǎng)條件：(1) 特殊的培養(yǎng)液：用DMEM培養(yǎng)液，其中胎牛血清的濃度和質(zhì)量很重要，加非必須氨基酸；β-巰基乙醇。(2) 以人或胚鼠的成纖維細胞為飼養(yǎng)層細胞。(3) 必須加入LIF，抑制細胞分化。,早期胚胎及PGCs的培養(yǎng),將早期胚胎或PGCs置于飼養(yǎng)層或條件培養(yǎng)基上，在5%CO2、37－39度條件下進行培養(yǎng)。培養(yǎng)液一般為DMEEM+15%FCS。培養(yǎng)液中可添加多種細胞因子或分化抑制物，如LIF.EGF.IGF. 3-巰基乙醇等。,

11、傳 代,進行體外培養(yǎng)時，當(dāng)ICM增殖后或PGCs出現(xiàn)ES樣克隆后即可傳代。ESC的增殖速度很快，小鼠ESC每7－8h倍增一次;豬類ESC每20h倍增一次;羊類ESC，每40－50h倍增一次;牛類ESC每18－24h倍增一次。傳代時一般是用胰酶EDTA消化，再用微吸管或撥針將其打散成單個細胞，然后移入新的飼養(yǎng)層上，培養(yǎng)幾天后，即可出現(xiàn)新的克隆點，在其分化之前可以再進行傳代。,5. 胚胎干細胞的鑒別 （1）細胞形態(tài)與結(jié)構(gòu) ES細

12、胞形態(tài)表現(xiàn)為胞體小、泡狀、核大 (核質(zhì)比高)、細胞聚集成集落生長（鳥巢狀）、細胞排列緊密、無細胞界限、能連續(xù)穩(wěn)定傳代且不分化。（2）細胞功能（3）細胞表面的特殊標(biāo)志：AKP陽性（4）細胞內(nèi)特異基因的表達,胚胎干細胞檢測指標(biāo),(1) 細胞內(nèi)堿性磷酸酶活性高(2) 端粒酶活性高(3) 不被Hoechst33342 和Rhodamine123染色(4) 細胞膜表面有特殊的標(biāo)記：SSEA-3, SSEA-4, 　 TRA-1

13、-60, TRA-1-81。(5) 能分化成三個胚層的細胞，將胚胎干細胞植　 入免疫缺陷小鼠皮下可產(chǎn)生畸胎瘤(6) 可誘導(dǎo)分化為各種成體干細胞,6. 兩種來源的ES細胞的區(qū)別,7. ES細胞的誘導(dǎo)分化,干細胞誘導(dǎo)分化的常用方法（1）加入誘導(dǎo)細胞分化的因子或化學(xué)物質(zhì)， 如VGEF、bFGF 、DMSO和RA等（2）將ES細胞與特定的細胞共培養(yǎng) （3）將某種分化誘導(dǎo)因子的基因轉(zhuǎn)入ES細

14、 胞內(nèi),四、 ES細胞的應(yīng)用前景,胚胎干細胞（ES）成為當(dāng)今生命科學(xué)和生物技術(shù)研究的熱點。這與它具有“發(fā)育全能性”的神奇功能密切相關(guān)。干細胞是未分化的原始細胞。其中，全能干細胞能分化成人體200多種細胞類型，形成機體的任何細胞、組織和器官。,,倘能掌握其分化發(fā)育的規(guī)律，在人工條件下定向分化為所需的細胞、組織乃至器官，就可以用來治療目前還難以或無法治愈的帕金森氏病、早老性癡呆、白血病、糖尿病等頑癥，并且解決十分緊缺的組織和器官移植

15、的來源問題嗎？進一步，與克隆技術(shù)相結(jié)合，運用體細胞核轉(zhuǎn)移技術(shù)來得到ES，還能解決細胞治療以及組織和器官移植的免疫排異難題。,1. 胚胎干細胞研究的意義,,,ES細胞特有的生物學(xué)特性,決定了其在生物學(xué)領(lǐng)域有著不可估量的應(yīng)用價值。 在進行ES細胞建系和定向分化的同時,以ES細胞為材料，在核移植、嵌合體、轉(zhuǎn)基因動物研究等方面也進行了廣泛的嘗試,已經(jīng)充分體現(xiàn)出ES細胞在加快良種家畜繁育、生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動物、哺乳動物發(fā)育模型、基因和細胞治療等方

16、面有著廣闊的應(yīng)用前景。,,近幾年來，胚胎工程技術(shù)、基因工程技術(shù)、組織工程技術(shù)與ES細胞研究的結(jié)合已經(jīng)成為現(xiàn)實，將使相關(guān)的基礎(chǔ)學(xué)科研究以及醫(yī)藥業(yè)、畜牧業(yè)等發(fā)生重大變化，走向一個新的時代。,2. 胚胎干細胞的用途,為在細胞和分子水平研究研究哺乳動物早期胚胎發(fā)育規(guī)律提供了良好的材料和方法，是基因功能研究的有效手段。細胞分化機制，細胞癌變機理用于新藥的發(fā)現(xiàn)、篩選及安全性實驗：如藥物機理及毒性實驗重要的臨床價值，可作為組織移植、細胞治療和基因

17、治療的細胞來源：制造細胞、組織和器官；人ES定向誘導(dǎo)分化為人體器官；生產(chǎn)用于人類器官移植的動物器官：無免疫排斥；豬可以作為人異種器官移植的器官供體來源。,,生產(chǎn)克隆動物：由于ES細胞是具有全能性、未分化的細胞，因此是制作克隆動物很好的核供體。 生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動物：建立轉(zhuǎn)基因細胞系，抗病育種；藥用蛋白,,ES細胞可作為基因打靶的靶細胞，經(jīng)打靶引入定點整合外源基因，提高轉(zhuǎn)基因動物的整合率和表達效果。 ES細胞也可進行基因敲除，獲得基因敲

18、除動物，如豬可以作為人異種器官移植的器官供體來源。,,在發(fā)育生物學(xué)基礎(chǔ)研究中，利用ES細胞研究細胞分化的機埋，有助于闡明細胞分化調(diào)節(jié)的機制。 ES細胞的多能性可以在一定培養(yǎng)條件下轉(zhuǎn)化為特定的細胞。試驗證明，體外誘導(dǎo)小鼠ES細胞的分化，可形成內(nèi)臟卵黃囊、心肌層，也可以得到神經(jīng)元樣細胞和成纖維樣的細胞。,,使人的ES細胞與豬等動物的胚胎結(jié)合，可得到人-豬嵌合體動物，由于ES細胞具有全能性，可分化形成不同胚層，包括某些器官，這樣的器官與

19、人的器官具有相同的免疫特性，因此它不會對人產(chǎn)生排異反應(yīng)。,,人的ES細胞也可在體外定向誘導(dǎo)培養(yǎng)，生產(chǎn)人的肌肉、神經(jīng)和造血細胞的細胞組織，在治療人的某些疾病上有重要的應(yīng)用價值?？茖W(xué)家們一直試圖誘導(dǎo)各種干細胞定向分化為特定的組織來替代那些受損的體內(nèi)組織，比如把產(chǎn)生胰島素的細胞植入糖尿病患者體內(nèi)。,,科學(xué)家們已經(jīng)能夠使豬ES細胞轉(zhuǎn)變?yōu)樘鴦拥男募〖毎?，使人ES細胞生成神經(jīng)細胞和間充質(zhì)細胞，并能使小鼠ES細胞分化為內(nèi)胚層細胞。這些結(jié)果為細胞和組

20、織替代療法開辟了道路。目前，科學(xué)家已成功分離到人ES細胞，而體細胞克隆技術(shù)為生產(chǎn)患者自身的ES細胞提供了可能。,治療性克?。后w細胞核移植（SCNT）　　去核卵細胞 + 體細胞核 ?克隆 ?囊胚 ?分離內(nèi)細胞群 ?ES細胞,,把患者體細胞移植到去核卵母細胞中形成重組胚，把重組胚體外培養(yǎng)到囊胚，然后從囊胚內(nèi)分離出ES細胞，獲得的ES細胞使之定向分化為所需的特定細胞類型 (如神經(jīng)細胞、肌肉細胞和血細胞)，用于替代療法。這種核移植法的最終

21、目的是用于干細胞治療，而非得到克隆個體，科學(xué)家們稱之為“治療克隆”。生殖性克隆,2.,ES細胞研究的倫理問題,ES研究也引發(fā)了當(dāng)前最為激烈而敏感的倫理之爭。主要圍繞兩個問題而展開：一是如何看待胚胎。ES主要有三個來源：（1）（自然和人工）流產(chǎn)的胚胎；（2）輔助生殖剩余的胚胎；（3）通過體細胞核轉(zhuǎn)移術(shù)得到的胚胎。,,不管哪一個來源，提取ES必定會損毀胚胎。于是，胚胎是不是生命，是不是人，研究ES是不是“毀滅生命”、“殺人”，

22、很自然地成為爭論的焦點。國內(nèi)認(rèn)為：與“胚胎”的生命相比，“人”的生命具有優(yōu)先權(quán)，可以殺死胚胎來救“人”的生命。,,另一焦點在于，是否必然滑向生殖性克隆。2003年10月，聯(lián)合國大會以80票贊成、79票反對、15票棄權(quán)的表決結(jié)果，將《禁止人的克隆生殖國際公約》推遲一年。世界各國都表示反對生殖性克隆，為什么這一國際公約通不過呢？因為79個國家認(rèn)為治療性克隆必然滑向生殖性克隆，主張二者同時禁止。治療性克隆是ES研究的主要目的。封殺治療

23、性克隆，實際上就是要封殺ES研究。,ES細胞技術(shù)的發(fā)展方向,ES細胞維持自我更新和定向分化的分子機理ES細胞治療技術(shù)的研究ES細胞作工具探討基因功能和個體的發(fā)生發(fā)育ES細胞治療中的免疫排斥問題治療型克隆技術(shù)分離ES細胞新途徑的研究用ES細胞生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因家畜,,ES細胞具有可以無限地傳代增殖，而且不改變其基因型和表現(xiàn)型的特點。 如果以ES細胞作為核供體進行核移植,可以在短時間內(nèi)獲得大量基因型和表現(xiàn)型完全相同的個體。

24、 而且用ES細胞與胚胎進行嵌合克隆動物,可以解決哺乳動物遠緣雜交的困難,生產(chǎn)出珍貴的動物,也可以進行異種動物克隆,有助于保護珍惜野生動物。,ES細胞與動物克隆,,盡管體細胞克隆與ES細胞克隆相比有著易于取材的特點，但是體細胞克隆也存在著不少缺點，如生理和免疫缺陷，目前體細胞克隆還不能完全代替ES細胞克隆。,ES細胞作基因載體 目前常用的生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動物的方法是向受精卵中注射DNA，外源基因的整合、表達和篩選工作是在個體水平上

25、進行的，不僅工作繁瑣，周期長成功率低，產(chǎn)生的后代的遺傳性狀也常出現(xiàn)分離；,,而利用ES細胞作為基因載體，得到基因整合的細胞，將載體ES細胞直接進行核移植或者通過與胚胎嵌合獲得嵌合動物，ES細胞在嵌合體中分化發(fā)育成全能性的生殖細胞，即可以得到攜有目的基因的轉(zhuǎn)基因動物。,,因為一個優(yōu)良的ES細胞系不僅可以用于各種目的基因轉(zhuǎn)化，用各種方法將外源DNA導(dǎo)入細胞，而且外源基因的整合數(shù)目、位點、表達程序以及穩(wěn)定性等都可以在細胞水平上進行加工，篩選，

26、在很大程度上加快了動物遺傳工程的進程。,,改善ES細胞的體外培養(yǎng)條件，建立更有效更簡便的獲得ES細胞的方法。定向誘導(dǎo)分化成特定類型細胞，用于臨床疾病的治療，并解決免疫排斥和潛在的致腫瘤的問題。成體干細胞的橫向分化的能力以及與胚胎干細胞的比較，成體干細胞能否替代胚胎干細胞？,,嵌合體實驗和克隆動物實驗是將ES細胞與正常的胚胎融合制作嵌合體或?qū)S細胞作為核供體進行核移植，產(chǎn)生克隆動物后代。這兩者是檢驗ES細胞的最有效、最有說服力的方法

27、。,,人的ES細胞可以高水平地表達端粒酶活性，二倍體的人體細胞不表達端粒酶，并且隨著年齡的增長端粒變短，而在組織培養(yǎng)達到一定增殖壽命時，就開始衰老。與此相反，端粒酶在生殖系和胚胎組織中都有很高的活性。ES細胞中的高水平端粒酶活性證實了它的壽命將超過體細胞。,,ES細胞系的分離效率低ES細胞定向誘導(dǎo)分化的理論和技術(shù)水平低：隨機的，運氣。,,解決胚胎來源有限的途徑： 未成熟卵的體外成熟,避免免疫排斥的方法（1）Kn

28、ock-out 胚胎干細胞的組織相 容性抗原（2）Knock-in 受者的組織相容性抗原（3）與同一來源的造血干細胞一同移植（4）受者的體細胞核移植,,,胚胎嵌合技術(shù)研究概況,嵌合體 (chimera)一詞源于古希臘神話，其意是指獅頭、羊身、龍尾等部分拼湊起來的怪獸。中國的“龍”：九似 圖騰在生物學(xué)上是指同一個體中，基因型相異的細胞或組織混合存在的狀態(tài)。,天然嵌合體？,,騾子：不是。是雜種,1.定義,嵌合體

29、動物是指由兩種或兩種以上具有不同遺傳性的細胞系組成的聚合胚發(fā)育成的個體。在卵裂期甚至受精卵期所形成的嵌合體為原發(fā)性嵌合體(成體中每個器官都有兩種類型的細胞）。胚胎發(fā)育的晚期，通過組織移植或嫁接等方法所形成的部分組織或器官的嵌合稱為次生性嵌合。,2.囊胚顯微注射法生產(chǎn)嵌合體,用顯微操作技術(shù)將供胚的全部內(nèi)細胞團注入除去部分內(nèi)細胞團的受胚囊胚腔中，或?qū)⒐┡叩牟糠謨?nèi)細胞團注入受胚的囊胚腔中，也可以向受胚囊胚腔中（或卵周間隙）注入16細胞至桑