海洋有害藻中毒素的液相色譜-質(zhì)譜篩查分析方法研究.pdf

1、近年來，隨著海洋環(huán)境污染日益加重，有害藻華發(fā)生頻率日趨增大，特別是部分有害藻華產(chǎn)生的生物毒素，不僅對海洋生態(tài)系統(tǒng)、海洋漁業(yè)和養(yǎng)殖業(yè)產(chǎn)生影響，更重要的是藻毒素通過食物鏈富集，對人體健康會造成潛在的毒害，甚至導(dǎo)致人類中毒死亡。迄今為止，已發(fā)現(xiàn)海洋藻毒素及其衍生物約有200多種，按毒素溶解性質(zhì)可分為兩大類：水溶性毒素和脂溶性毒素。由于有害藻華毒素種類多，且每一類毒素包含多種毒素單體，有害藻華爆發(fā)后，海洋環(huán)境管理部門快速確定是否是產(chǎn)毒藻華，產(chǎn)生

2、何種毒素，就成為有害藻華災(zāi)害應(yīng)急管理的首要任務(wù)，因此，急需發(fā)展針對有害藻華藻中各類毒素快速篩查和鑒別的有效方法。本研究采用液相色譜–質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（LC–MS），首先對8種典型水溶性藻毒素在電噴霧離子源負(fù)模式下的質(zhì)譜裂解規(guī)律進(jìn)行了研究，在此基礎(chǔ)上，發(fā)展了基于毒素化合物精確質(zhì)量數(shù)篩選的有害藻中20多種水溶性毒素同步篩查鑒別方法；此外，采用反相液相色譜與親水作用色譜串聯(lián)分離–高分辨質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了20多種水溶性毒素與200多種脂溶性藻毒素

3、的同步篩查鑒別分析，具體內(nèi)容如下：
　　1.麻痹性貝毒（Paralytic Shellfish Poisoning toxins，PSP toxins）是有害藻華毒素中毒性最大，影響最為廣泛的水溶性藻毒素。針對8種常見含硫 PSP毒素（GTX1、GTX4、GTX2、GTX3、dcGTX2、dcGTX3、C1和C2）的化學(xué)結(jié)構(gòu)特征，利用多級離子阱質(zhì)譜技術(shù)對其在電噴霧質(zhì)譜負(fù)離子模式條件下的分析特征進(jìn)行了研究。結(jié)果顯示，8種目標(biāo)化合物在

4、一級質(zhì)譜分析過程中均易失去1個(gè)H，形成準(zhǔn)分子離子[M–H]–峰；在二級質(zhì)譜分析過程中各化合物的母離子（[M–H]–）主要通過丟失–H2O和–NHCO等中性碎片，形成穩(wěn)定的特征子離子峰，并且同分異構(gòu)體的二級質(zhì)譜圖有差異，可為含硫PSP毒素的二級質(zhì)譜定性、定量分析提供依據(jù)。此外，對各目標(biāo)化合物的二級質(zhì)譜主要碎片峰進(jìn)行了三級質(zhì)譜分析，對三級質(zhì)譜分析產(chǎn)生的主要特征碎片峰進(jìn)行了歸屬，并對裂解途徑進(jìn)行了推測，可為電噴霧質(zhì)譜在負(fù)離子模式條件下檢測有害

5、藻中含硫PSP毒素提供參考和依據(jù)。
　　2.針對有害藻中的常見PSP毒素，采用親水作用色譜–高分辨電噴霧質(zhì)譜法（HILIC–HR–ESI/MS）結(jié)合PSP毒素精確質(zhì)量數(shù)數(shù)據(jù)列表篩查，建立了快速篩查、定性識別有害藻中25種已知PSP毒素的方法。產(chǎn)毒藻細(xì)胞破碎后經(jīng)0.1 mol/L乙酸溶液提取，通過HILIC–HR–ESI/MS正負(fù)離子模式全掃描分析，得到產(chǎn)毒藻提取物中PSP毒素準(zhǔn)分子離子精確質(zhì)量數(shù)，結(jié)合PSP毒素?cái)?shù)據(jù)列表篩查并輔以商

6、品化軟件數(shù)據(jù)分析，實(shí)現(xiàn)產(chǎn)毒藻中PSP毒素的快速定性識別。建立的數(shù)據(jù)列表包含25種常見PSP毒素精確分子質(zhì)量及碎片離子信息，所發(fā)展的HILIC–HR–ESI/MS方法分離度高、靈敏度好，所考察的10種常見PSP毒素檢測限在10~80 nmol/L范圍內(nèi)，能滿足產(chǎn)毒藻實(shí)際樣品的分析要求。3種產(chǎn)毒藻實(shí)際樣品篩查、分析結(jié)果良好，說明本方法是有害藻華產(chǎn)毒藻中多種已知PSP毒素快速篩查、定性識別的有效方法。
　　3.采用反相液相色譜串聯(lián)親水作

7、用色譜–高分辨電噴霧質(zhì)譜法（RPLC/HILIC–HR–ESI/MS），結(jié)合藻毒素精確質(zhì)量數(shù)數(shù)據(jù)列表篩查，建立了同步篩查鑒別產(chǎn)毒藻中水溶性和脂溶性藻毒素的新方法。首先，對產(chǎn)毒藻細(xì)胞進(jìn)行超聲破碎處理，然后，以甲醇/0.1 mol/L乙酸（1:1，V/V）混合溶液為溶劑進(jìn)行超聲波輔助提取，最后，粗提液通過 RPLC/HILIC–HR–ESI/MS正負(fù)離子模式全掃描進(jìn)行分析；其中，RPLC柱與HILIC柱通過三通相連接，RPLC柱采用低流速高

8、比例水相（0.2 mL/min,80％水）沖洗，而HILIC柱則采用高流速高有機(jī)相（1 mL/min,85%乙腈）沖洗，實(shí)現(xiàn)水溶性和脂溶性藻毒素在一次進(jìn)樣分析中的同步分離檢測。為了驗(yàn)證方法的可靠性，選取11種典型水溶性藻毒素和8種典型脂溶性藻毒素，對方法的重復(fù)性和靈敏度進(jìn)行了考察，19種典型毒素化合物峰面積的RSD值均低于4.55%，保留時(shí)間的RSD值均低于0.96%；日內(nèi)重復(fù)性的RSD值在4.38~7.92%范圍內(nèi)，日間重復(fù)性的RSD