尼克酰胺na在細(xì)胞

1、1 Introduction 2 Methods 3 Results 4 Discussion,1 Introduction,1 尼克酰胺（Nicotianamine，NA），是一種金屬螯合劑，普遍存在于高等植物中，NA可螯合金屬陽離子。研究認(rèn)為NA在植物體內(nèi)Fe和其他金屬的運(yùn)輸過程中起作用。NA也可能與Fe（Ⅲ）作用保護(hù)細(xì)胞免受氧化脅迫的傷害。但是，在高等植物中NA準(zhǔn)確的作用仍不清楚。,2 尼克酰胺氨基轉(zhuǎn)移

2、酶（Nicotianamine aminotransferase ，NAAT）催化NA的氨基轉(zhuǎn)變，在禾本科植物中，NAAT是獲得Fe所必需的。NAAT為禾本科植物所特有。,3 麥根酸類植物高鐵載體（Mugineic acid family phytosiderophores，MAs），由禾本科植物根系分泌，它是一類低分子量的非蛋白氨基酸，可溶解土壤中的Fe，是天然的Fe螯合肽 。NAAT是MAs合成過程中的關(guān)鍵酶(Fig 1)，催化NA

3、的氨基化，是MAs生成過程中的一個(gè)基本媒介，MAs只有在禾本科植物中產(chǎn)生。 注：在缺鐵脅迫下，禾本科植物根系分泌出MAs ，活化土壤中難溶的三價(jià)鐵化合物，然后在專一的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的作用下將Fe3+-MAs 轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)胞質(zhì)中，從而被植物利用。,4 MAs的生物合成途徑,為了研究非禾本科植物中NAAT產(chǎn)生異常的原因，把包含花椰菜病毒的35S啟動(dòng)子與hvnaat-A基因編碼區(qū)結(jié)合的載體轉(zhuǎn)入煙草（產(chǎn)生NA但是不產(chǎn)生植物鐵載體），表達(dá)NAAT基因

4、的轉(zhuǎn)基因煙草植物（naat煙草）的幼葉有網(wǎng)紋狀失綠癥，花的形狀異常且不育，naat煙草可產(chǎn)生大量的NAAT，從而使得NA短缺。 本文描述轉(zhuǎn)基因煙草表達(dá)大麥NAAT基因和在植物中NA消耗的表型，并試探就NA在細(xì)胞內(nèi)金屬運(yùn)輸和植物生殖發(fā)育過程的作用。,2 Methods,1 二元載體構(gòu)建：缺鐵大麥根部中分離hvnaat-A cDNA— 在pUC118菌株SmaI位點(diǎn)克隆—pUC118-hvnaat-A用XbaI

5、和SacI進(jìn)行融合—克隆在pIG121Hm 菌株中。,2 植物材料和生長條件：1）通過三親株交配—二元載體pIG121Hm-hvnaat-A 被引入到根瘤農(nóng)桿菌株C-58—煙草中進(jìn)行轉(zhuǎn)化和再生—離體煙草腋芽T0嫁接到nas煙草上——收獲naat煙草T1的種子—在nas煙草上繼續(xù)嫁接獲得T2。2）Naat煙草（T2），nas煙草，野生型煙草和對照煙草生長在裝有蛭石的盆里，條件為25C (day/night)，自然光照，每天用稀釋100

6、0倍的Hyponex 營養(yǎng)液澆灌植物，培養(yǎng)后作為實(shí)驗(yàn)材料。 注：Nas煙草也是轉(zhuǎn)基因植物，是使用具有花椰菜病毒35S啟動(dòng)子- hvnas1基因插入pBIGRZ1菌株轉(zhuǎn)化而成，并被證明超表達(dá)NAS（nicotianamine synthase）基因。,3 DNA凝膠電泳分析：DNA的提取—分離—電泳—擴(kuò)增—雜交—拍照4 RNA凝膠電泳分析：RNA的提取—變性—電泳—擴(kuò)增—雜交—拍照5 尼克酰胺氨基轉(zhuǎn)氨酶（NAAT）的分析：

7、用HPLC分析6 葉片的顯微結(jié)構(gòu)和超微結(jié)構(gòu)觀察：環(huán)氧樹脂切片法7 金屬濃度的測定：發(fā)射光譜儀測定8 金屬在葉片中的分布： 同步加速器誘導(dǎo)輻射X-射線熒光光譜儀（XRF）觀察,9 NA的提取和分析：用HPLC進(jìn)行定量分析 10 失綠葉葉綠素的測定 ：用SPAD-502葉綠素儀測定 11 花型異常的逆轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)：離體腋芽用五個(gè)溶液處理：(1) 0 µM NA+20µM 檸檬酸Fe(III)；(2) 20

8、1;M NA+20 µM FeCl3，(3) 20µM NA+20µM FeSO4，(4) 20µM NA+20µM檸檬酸Fe(III)， (5) 100µM NA+20 µM 檸檬酸Fe(III),12 Naat煙草在nas煙草上的嫁接： 以nas煙草為砧木，去除葉子，把naat煙草嫁接于上(Figure 9A)。進(jìn)行兩次嫁接試驗(yàn)以獲得足量的種

9、子。最后，再嫁接離體煙草（T2naat煙草）進(jìn)行分析。,3 Results,1 大麥naat-A基因在煙草中的整合及其表達(dá),2 轉(zhuǎn)基因煙草（naat煙草）的表型具失綠癥,幼葉失綠癥是植物金屬缺乏的普遍癥狀。因此，作者通過電感耦合等離子發(fā)射光譜儀測定了naat煙草和對照葉片中的四種金屬（Cu、Fe、Zn和Mn）的濃度和分布。,3 葉片中金屬的濃度和分布,naat煙草葉片中金屬水平的降低表明植物內(nèi)部金屬的運(yùn)輸已經(jīng)改變。因?yàn)镹A是NAAT的

10、酶作用物，可以想象NAAT的大量產(chǎn)生消耗了這個(gè)部位的NA，內(nèi)源NA的短缺導(dǎo)致naat煙草內(nèi)部金屬的運(yùn)輸產(chǎn)生缺陷。為此，作者測量了naat煙草和對照煙草葉片的內(nèi)源NA。,4 naat煙草中NA的濃度,5 NA-Fe處理失綠癥被逆轉(zhuǎn) 為了驗(yàn)證naat煙草的失綠癥是由于NA的短缺所造成的，供給naat煙草Fe或Fe+NA 。離體的naat煙草用以下五種溶液處理：（1）FeCl3，（2）FeSO4（3）檸檬酸鐵（4）Fe

11、Cl3+NA（5）FeSO4+NA,Fig6 naat煙草失綠癥的逆轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn),(D) SPAD values and concentrations of metals in young naat tobacco leaves treated with the five solutions.Fig6 naat煙草失綠癥的逆轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn),,上述結(jié)果顯示雖然NA和檸檬酸鹽可促進(jìn)Fe向幼葉運(yùn)輸，但只有NA促進(jìn)Fe向失綠區(qū)運(yùn)輸。用檸檬酸鐵處理的幼葉的S

12、PAD 值比用FeSO4 、FeCl3的高，這個(gè)結(jié)果也表明，在螯合劑（NA和檸檬酸鹽）缺乏的情況下，F(xiàn)e的運(yùn)輸很小。再者，用含有NA的鐵鹽溶液處理的幼葉Cu、Zn、Mn的濃度也很高，這也表明NA也促進(jìn)這些金屬的運(yùn)輸。,因?yàn)橹挥蠳A-Fe溶液逆轉(zhuǎn)了naat煙草的失綠癥，使用59Fe去探究NA是否促進(jìn)葉內(nèi)Fe的運(yùn)輸。用NA-59Fe或者不加NA的59Fe處理離體的naat煙草腋芽，處理6h后，葉片中的59Fe通過放射能照像可顯示出來（Fig

13、6E）。,(E) Uptake and distribution of 59Fe in naat tobacco leaves treated without NA（-NA+59Fe)or with NA（+NA+59Fe） for 6 h (analysis performedin duplicate). Fig6 naat煙草失綠癥的逆轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn),6 不正常的花型和不育1）野生型與對照煙草表型：五個(gè)花瓣，花色粉紅，花粉在開花以前釋放

14、，圓錐花序或聚傘形花序頂生，孢蒴卵形。2）Naat煙草表型：有兩種類型的異型花。 Type-I 的花與The type-II 的花。,1）Type-I 的花 ：開花早，花蕾形狀異常，煙草的第一個(gè)花蕾最不正常，并且 type-I的花比野生型的花有更大更厚的萼片。A 放射花瓣 ，花瓣絲狀。B 花器官異常： 花瓣?duì)钶嗥?、雄蕊，花瓣與花絲融合 C 花冠開裂 D 花器官數(shù)量不正常 ：雄蕊、花瓣和心皮 數(shù)量不正常（多或少）E 混合花：

15、兩個(gè)花共有萼片，或幾個(gè)特征的混合。,6 不正常的花型和不育Figure 7. Inflorescences of Wild-Type Tobacco and Type-I naat Tobacco.,,2）type-II 的花：發(fā)育明顯不同于type-I 花，開花晚，type-II的花與野生型的花有一些相似的特征，有正?；ㄐ?，萼片、雄蕊、花瓣顏色相近，并且花粉囊產(chǎn)生少量的花粉。,Figure 8. Infloresc

16、ences of Wild-Type Tobacco and Type-II naat Tobacco.,在 naat 煙草中，兩種類型的花產(chǎn)生的花粉數(shù)量少，花粉在花開放幾天后釋放?；ǚ哿]有充滿花粉囊，花粉粒形狀像箭頭 ，花絲是粉色而不是白色。與野生型煙草相比，在naat煙草花的花粉囊的橫向部分顯示有少量的花粉，這些花粉沒有發(fā)育。另外，畸形的雌蕊或長或短，且經(jīng)常觀察到柱頭形狀不規(guī)則，所有的 naat煙草植物 的葉表現(xiàn)為失綠癥且不育。,

17、作者通過野生型煙草和naat 煙草雜交來探究生殖器官不育的可能原因。野生型花粉被涂到naat煙草的柱頭上，或者naat煙草的花粉被涂到野生型花粉的柱頭(Table1)。,雜交結(jié)果： 野生型煙草雌蕊×naat 煙草花粉：孢蒴中的種子量少，但都成熟了。相反，野生型煙草花粉×naat 煙草雌蕊：產(chǎn)生11個(gè)孢蒴，只有一個(gè)有少量種子。這些種子小而輕且為棕色。這表明naat 煙草的雌蕊和雄蕊都有完成受精的能力

18、。 但是，在naat 煙草中花粉的數(shù)量不能有效的完成生殖，而且naat 煙草的雌蕊由于缺少NA使得金屬供應(yīng)短缺，故不能產(chǎn)生成熟的種子。因此，naat 煙草的不育出現(xiàn)了三個(gè)結(jié)果，（1）花粉產(chǎn)量少，（2）花粉囊開裂晚，（3）受精之后卵不成熟。,7 生殖器官形態(tài)異常通過NA處理被逆轉(zhuǎn) 為了探究內(nèi)源NA短缺是否導(dǎo)致花序的形態(tài)異常，與Fig6A的描述的方法相同，除了改變NA的濃度，供給naat煙草NA，離體

19、naat煙草用五個(gè)溶液處理(Table 2) 100µMNA和20µM檸檬酸鐵可逆轉(zhuǎn)這種形態(tài)異常,A 20µM檸檬酸鐵 B 100µMNA+20µM檸檬酸鐵,8 通過嫁接育性被恢復(fù)（Fig 10） 為了檢測內(nèi)源NA短缺是否會(huì)導(dǎo)致不育，把naat煙草嫁接到野生型煙草上或者轉(zhuǎn)基因植物nas煙草上（超表達(dá)大麥煙堿酰胺合酶基因H

20、vNASl） naat煙草嫁接到野生型煙草上后盡管幼葉的失綠癥被恢復(fù)，但育性不能被恢復(fù)；花粉囊部分正常，但種子不成熟（文中沒有顯示數(shù)據(jù)）。 嫁接在nas煙草上的naat煙草恢復(fù)了育性，且葉片沒有失綠癥。,Figure 10. Recovery from Sterility by Grafting.,Figure 10. Recovery from Sterility by Grafting.,

21、Figure 10. Recovery from Sterility by Grafting.,由上圖可知嫁接在nas煙草上的naat煙草恢復(fù)了育性，且葉片沒有失綠癥。另外，大多數(shù)花粉囊正常，粉紅色的雄蕊花絲逆轉(zhuǎn)為白色，花粉粒完全發(fā)育，種子成熟。然而，多數(shù)種子發(fā)育不完全，且種皮皺縮，成熟種子的數(shù)量下降。從嫁接植物獲得的成熟種子發(fā)芽正常，但是幼苗的葉片有失綠癥，花序形態(tài)不正常且不育，(數(shù)據(jù)沒有顯示)。說明育性與NA有極大的關(guān)系。,9 嫁接

22、在nas煙草上的naat煙草各器官的金屬濃度（Fig11）,這些結(jié)果表明，把naat煙草嫁接在nas煙草上后可提供naat煙草NA，因此naat煙草花的Fe、Cu、Zn都有明顯的升高。,10 NtNAS表達(dá)(Fig12) RNA凝膠電泳分析探究了在煙草花中的NAS表達(dá)（Figure 12）。本文分析了開花第一天成熟花蕾的四種花器官（花瓣、花絲、雌蕊、花粉囊）。NtNAS 在所有花器官中都得到了表達(dá)，這比表明花序

23、中產(chǎn)生的NA是正常花發(fā)育所要求的。尤其，NtNAS在雄蕊花絲中的高度表達(dá)表明在運(yùn)輸金屬給花粉囊的過程中NA具有重要作用。,4 Discussion and possible conclusion,1 naat煙草的表型與NA有關(guān) 表達(dá)大麥naat-A基因的naat 煙草幼葉具有明顯的NAAT活性，這導(dǎo)致NA在這一部位被嚴(yán)重消耗。因此，內(nèi)源NA在naat煙草中沒有被檢測到，而在對照中含量顯著。這表明naat 煙草的

24、表型主要是內(nèi)源NA缺乏的結(jié)果。,2 NA是Fe在葉脈間以及葉脈到交錯(cuò)區(qū)運(yùn)輸所必需的(1) 在naat煙草幼葉的四種金屬，尤其是Fe和Cu的濃度比對照煙草葉的低。再者，在對照煙草葉中，F(xiàn)e主要分布在葉脈和幼葉的失綠區(qū)，相反，在naat煙草中，在葉脈只有少量的Fe，在失綠區(qū)Fe的數(shù)量極少，這個(gè)結(jié)果表明，naat煙草幼葉缺鐵， 故可得出結(jié)論，naat煙草幼葉失綠癥是由于運(yùn)輸?shù)饺~片的Fe不足所致，尤其在失綠區(qū)。,(2) 單一用Fe處理naat

25、煙草，失綠癥不能逆轉(zhuǎn)，檸檬酸鐵處理增加了幼葉的Fe含量，但是也不能逆轉(zhuǎn)失綠癥，表明檸檬酸鹽可運(yùn)輸Fe到幼葉但是不能到達(dá)失綠區(qū)。Fe+NA的處理增加了Fe的濃度并且逆轉(zhuǎn)失綠癥。添加外源的59Fe和NA時(shí)，59Fe立即被運(yùn)輸?shù)絥aat煙草幼葉的葉脈和失綠區(qū)。這些結(jié)果表明NA加強(qiáng)了Fe向幼葉葉脈和失綠區(qū)的運(yùn)輸。,(3)添加NA的溶液處理幼葉也增加了Cu和Zn 的濃度，表明NA也促進(jìn)這些金屬向幼葉運(yùn)輸。在naat煙草中的四種金屬濃度，在幼葉和花

26、中，下降的順序都相似，依次為Mn< Zn<Fe<Cu。在naat煙草中金屬濃度的下降可歸于內(nèi)源NA的虧缺。,3 NA是生殖生長和受精必需的 100µMNA+ 檸檬酸鐵的處理，可克服花形態(tài)異常、花粉成熟缺陷和花粉囊晚開裂 。如果在某一部位NAAT沒有消耗NA，濃度小于100µM的NA可能會(huì)逆轉(zhuǎn)花的形態(tài)異常。因此，低濃度的NA影響花的形態(tài)。由此可得出一些重要的結(jié)論：正?；òl(fā)

27、育比正常的葉發(fā)育要求更高的NA濃度。在生殖時(shí)期檸檬酸鹽不能代替NA，也不能作為Fe養(yǎng)份從幼葉葉脈轉(zhuǎn)運(yùn)到失綠區(qū)。NA和Fe都是花正常發(fā)育所必需的，并且同時(shí)添加NA和檸檬酸鐵對正常的花發(fā)育是有效的。Cu和Zn也參與正常的花發(fā)育。,嫁接在野生型煙草上的naat煙草可以逆轉(zhuǎn)失綠癥和花型異常，但是不能逆轉(zhuǎn)不育。嫁接在nas煙草上的naat煙草可逆轉(zhuǎn)幼葉的失綠癥、花型異常、花粉成熟缺陷、花粉囊晚裂和不育。因?yàn)橐吧蜔煵莓a(chǎn)生的NA比nas煙草的

28、少（數(shù)據(jù)沒有顯示），可能是野生型煙草產(chǎn)生的NA的量不能有效補(bǔ)償NAAT消耗的內(nèi)源NA，從而沒有足夠的NA運(yùn)送到種子。 嫁接在nas煙草上的naat煙草花的Fe、Cu、Zn的濃度都增加了，且nas煙草花中的Fe、Cu、Zn比野生型的高。但nas煙草中Cu的濃度不高，表明NA可能參與Cu的動(dòng)態(tài)平衡。嫁接試驗(yàn)的結(jié)果表明，種子成熟比葉和花的正常發(fā)育需要的NA多， 而且NA影響花中的金屬濃度。這些結(jié)論表明NA是正?；ㄐ蛐纬伞⒄；ǚ郛a(chǎn)

29、生和種子成熟所必需的。,4生殖時(shí)期金屬的重要性 Fe、Cu、Zn、和 Mn在植物生殖階段是很重要的，因?yàn)樵谶@個(gè)時(shí)期，這些金屬是許多關(guān)鍵蛋白的組分。在naat煙草中雌蕊長度異?？赡苁怯捎贔e缺乏導(dǎo)致酶合成紊亂所致。,5 NA充當(dāng)金屬載體 naat煙草中的嫁接實(shí)驗(yàn)和金屬濃度顯示NA促進(jìn)Fe、Cu、Zn向花器官和種子運(yùn)輸?；ㄆ鞴僦蠳tNAS的表達(dá)也表明NA促進(jìn)金屬向花序運(yùn)輸。尤其NtNAS 在雄蕊

30、花絲的表達(dá)說明花粉囊花粉的成熟需要NA來運(yùn)輸金屬。在幼葉和花中，檸檬酸鹽不能代替NA。這些結(jié)果表明，NA通過存在于幼葉、花序和種子中特異的NA-金屬載體運(yùn)輸金屬到生殖器官細(xì)胞。,6 NA可能影響Zn-指蛋白的作用 Naat煙草的不育可能與這些Zn指蛋白有關(guān)系，由于NA的短缺而導(dǎo)致缺Zn，影響Zn指蛋白的作用，從而導(dǎo)致不育。另外，如果NA作為細(xì)胞間金屬載體而起作用，NA的缺乏可能抑制Zn到蛋白質(zhì)的準(zhǔn)確轉(zhuǎn)運(yùn)或者抑制

31、Zn從蛋白質(zhì)上脫離，F(xiàn)IL是參與形態(tài)發(fā)生的Zn指蛋白之一，F(xiàn)IL是決定花正確數(shù)量和位置的關(guān)鍵蛋白。Naat煙草的花表型異常可能與FIL的正常表達(dá)有關(guān)。 NA和EDTA一樣，是金屬的螯合劑，可能是通過NA供應(yīng)或者去除Zn來調(diào)節(jié)Zn指蛋白。這種可能性表明NA影響細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子的相互作用。,7 NA影響Fe結(jié)合蛋白的作用 NA可能調(diào)節(jié)Fe結(jié)合蛋白中的Fe，它主要在雌配子體的中央細(xì)胞、胚乳的起源中表達(dá) ，它的DNA糖基化

32、結(jié)構(gòu)域有一個(gè)(4Fe-4S)2+ 。胚乳基因和種子育性需要Fe結(jié)合蛋白。 NA也可能影響開裂。缺鐵花的花粉囊正常開裂，即使有少量花粉。相反，由于需求茉莉酸，naat煙草延緩花粉囊開裂。因?yàn)楸┭趸厦甘擒岳蛩嵘锖铣傻囊粋€(gè)關(guān)鍵酶，此酶有亞鐵血紅素-Fe ，它可能受NA影響。折中一下，NA可能直接影響花粉囊壁的干燥。,總之，我們展示了NA的各種作用，尤其是生殖階段的作用。長期以來，已經(jīng)假設(shè)NA是Fe、Zn和Mn經(jīng)由韌皮部進(jìn)行