蘇云金芽胞桿菌新異殺蟲晶體蛋白基因的克隆與基因工程菌WG-001的安全評(píng)估.pdf

1、華中農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文蘇云金芽胞桿菌新異殺蟲晶體蛋白基因的克隆與基因工程菌WG001的安全評(píng)估姓名：張振宇申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士專業(yè)：生物化學(xué)與分子生物學(xué)指導(dǎo)教師：孫明20051101摘要新的蘇云金芽胞桿菌晶體蛋白的克隆對(duì)于控制害蟲對(duì)蘇云金芽胞桿菌殺蟲劑的抗性和研究晶體蛋白對(duì)蘇云金芽胞桿菌的生物學(xué)意義等理論研究都具有重要意義。在本文第一部分中，在以往從“無毒”菌株中發(fā)現(xiàn)其晶體蛋白對(duì)特定生物體具有毒殺作用的諸多實(shí)例的啟發(fā)下，以實(shí)驗(yàn)室保藏菌種

2、材料中部分晶體蛋白成分較新異且未發(fā)現(xiàn)殺蟲活性的菌株為研究對(duì)象，進(jìn)行了晶體蛋白基因的克隆，并成功的從華中亞種的標(biāo)準(zhǔn)菌株YBT978中成功的克隆到cry7Bal，為cry7群中新亞群，其表達(dá)產(chǎn)物對(duì)小菜蛾具有商效殺蟲活性；這為尋找新異殺蟲晶體蛋白基因開辟了新的思路。本文第二部分進(jìn)行了蘇云金芽胞桿菌基因工程菌WG一001的安全評(píng)估，包括工程菌WG001的定檀能力、傳播擴(kuò)散能力、對(duì)土著微生物的影響、遺傳變異能力以及特異基因crylAa和crylA

3、c水平轉(zhuǎn)移能力五個(gè)方面的內(nèi)容，初步證明其對(duì)南方蔬菜地土壤環(huán)境有很高的安全性，為其推廣應(yīng)用提供了安全性實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)支持。具體結(jié)果如下：1篩選出BMBl518、YBT978、L60、NXPl504、PBt53、HZ3904、LTlL57、NARCBtl7、EAl5196、EAl4696、T70。其中，BM咀1518、YBT978、L60、NXPl504、EAl5196的晶體蛋白已轉(zhuǎn)至pVDF膜，BMBl519的45kD晶體蛋白、YBT978的1

4、30kD晶體蛋白、EAl5196的42kD晶體蛋白已測得N末端15個(gè)氨基酸序列。。2構(gòu)建了YBT978的基因組BAC文庫。同時(shí)根據(jù)YBT978的130kD晶體蛋白N末端15個(gè)氨基酸序列，采用結(jié)合接頭的PCR擴(kuò)增方法獲得了此130kD晶體蛋白對(duì)應(yīng)基因N端的DNA序列，據(jù)此設(shè)計(jì)了引物130A12和130S12，用于從YBT978的基因組BAC文庫中篩選含有130kD晶體蛋白基因的克隆子。對(duì)得到的陽性克隆子進(jìn)行亞克隆，最終獲得了3465bp的

5、130kD晶體蛋白基因編碼區(qū)，并預(yù)測了RBS序列和Btl、BtlI重疊雙啟動(dòng)子，終止子，以及全部的8個(gè)保守區(qū)。此多肽與其它己知的Cry與Cyt蛋白的氨基酸序列比較結(jié)果表明它與Cry7Ab2最相似，identity達(dá)到了582％；其中，其C端序列非常相似，identi諺為879％，而N端序列的相似度較低，identity為371％。此晶體蛋白已被殺蟲晶體蛋白基因命名委員會(huì)命名為Cry7Bal，為Cry7群的新亞群。將cry7Bal轉(zhuǎn)入無晶

6、體突變株CryB，能形成晶體蛋白與野生菌株YBT978形狀和大小相似的雙金字塔形伴胞晶體，其晶體蛋白成分為預(yù)期的130kD大小。生測結(jié)果表明，伴胞晶體無毒的YBT978表達(dá)的Cry7Bal蛋白在體外溶解后對(duì)小菜蛾具有高毒力。由于Cry的N端為其毒力核心區(qū)域，因此根據(jù)Cry7Bal的N端與己知Cry的相似度很低的特點(diǎn)，推測此晶體蛋白識(shí)別昆蟲中腸上皮細(xì)胞上新異的受體，具有很高的開發(fā)價(jià)值。cry7Bal的發(fā)現(xiàn)從一定程度上預(yù)示在眾多被認(rèn)為“無毒