人β珠蛋白基因hs2兩個at富含區(qū)體外結(jié)合反式因子與hs3.5體內(nèi)dna蛋白質(zhì)相互作用的研究

1、中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文人β-珠蛋白基因HS2兩個AT富含區(qū)體外結(jié)合反式因子與HS3.5體內(nèi)DNA-蛋白質(zhì)相互作用的研究姓名：徐冬冬申請學(xué)位級別：博士專業(yè)：生物化學(xué)與分子生物學(xué)指導(dǎo)教師：梁植權(quán);劉德培2000.6.1， 中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文本工作采用電泳遷移率變動分析( E l e c t r o p h o r e t i cM o b i l i t y S h tf tA s s a y ，E M S A ) 、固相D

2、 N a s e I 足紋技術(shù)( s o l i d —p h a s e D N a s e If o o t p r i n t i n gt e c h n i q u e )研究了H S 2 中兩個A T 富含區(qū)上反式作用因子的結(jié)合狀況并對該反式作用因子的結(jié)合進(jìn)行了初步定位；通過磁珠／D N A 富集序列特異性反式作用因子、s D s —P A G E 凝膠電泳確定了該因子的分子量；最后對序列特異蛋白質(zhì)N 一末端測序。支／7／實

3、驗結(jié)果如下：’＼( I ) ．用含兩個完整A 1 1 區(qū)域( 1 2 0 b p ) 的片段為探針與不同細(xì)胞來源的核抽提物作E M S A 分析發(fā)現(xiàn)：在人源的紅白血病細(xì)胞系K 5 6 2 細(xì)胞的孩抽提物中存花與該區(qū)域特異結(jié)合的蛋白因子，而在鼠源的紅白血病細(xì)胞系M E L 細(xì)胞和非紅系的t l e L a 細(xì)胞核抽提物中未發(fā)現(xiàn)該種蛋白因子的存在。( 2 ) ．分別制備各含有一個A T 區(qū)( 4 9 b p 和7 5 b p ) 的片段，以

4、這兩個片段為探釗‘，分別與K 5 6 2 細(xì)胞來源的核抽提物作E M S A 分析．比較這兩個片段上的結(jié)合因子的差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩個A T 區(qū)上均有蛋白因子結(jié)合，通過蛋白競爭實驗確定．第一個A T 富含區(qū)上的因子為特異性的。( 3 ) ．采用固相D N a s e I 足紋技術(shù)，證實了第一個A T 富含區(qū)有序列特異因子結(jié)合，此因子的覆蓋D N A 序列為( 只顯示編碼鏈) ：5 ，一T G A A T A T A T A T A T A

5、T A T A T A T A T A 一3 ，( 4 ) ．通過蛋白結(jié)合和競爭實驗、S D S - - P A G E 凝膠電泳、銀染分析估算此序列特異蛋白的分子量約為2 8 K D 。( 5 ) 。該序列特異蛋白的N - - 末端測序結(jié)果為：甘氨酸一賴氨酸一甘氨酸一天冬氨酸一脯氨酸一天冬酰胺一賴氨酸一脯氮酸一精氨酸一1 1 ’氨酸( G K G D P N K P R G ) ，共l O 個氨基酸。通過上網(wǎng)分析比較，未發(fā)現(xiàn)有同源序列

6、。上述結(jié)果提示L C RH S 2 的第一個A T 富含區(qū)體外結(jié)合的因子很可能是目前尚未被鑒定的、與珠蛋白基因紅系組織特異性表達(dá)相關(guān)的反式作用因子。 L， 一／第二部分：、在轉(zhuǎn)基因鼠體內(nèi)賦予相連珠蛋白基因以位置非依賴性表達(dá)的最小片段皺稱為各個高敏位點的核心區(qū)域( H S c o r e ) 。這些核心區(qū)域一般為2 0 0 —4 0 0 b p ，是D N a s e [ 高敏位點的集中區(qū)域。以往的研究主要集中在各} i s 位點的核心區(qū)