大腸桿菌表達菌株bl21de3的改造——e.colibl21de3lpxm突變菌株的構建;破菌時可自動降解宿主核酸的大腸桿菌表達宿主菌的構建

1、分類號U D C密 級單位代碼y 9 { 0 7 4 81 0 5 3 7湖南農業(yè)大學碩士學位論文大腸桿菌表達菌株B 乙2 1 ( D E 3 _ ) 的改造——叵0 0 1 1 1 3 L 2 1 ( D E 3 ) ] p x g 突變菌株的構建；破菌時可自動降解宿主核酸的大腸桿菌表達宿主菌的構建C o n s t r u c t i o no f a m o d i f i e d E s c h e r i c h i a c

2、o l iB L 2 1f D E 3 )——C o n s t r u c t i o no f a M u t a n t E ．c o l i B L 2 1 ( D E 3 ) w i t h i n a c t i v a t e dl p x M ；C o n s t r u c t i o no f a m o d i f i e d E , c o l ip r o t e i np r o d u c t i o ns

3、 t r a i n ，c a p a b l eo f a u t o h u d r o l y s i n g h o s tn u c l e i c a c i dd u r i n g c e l ll y s i s研究生姓名 張 君指導教師 謝達平 教授副指導教師 方宏清 副研究員學科專業(yè) 生物化學與分子生物學研究方向 生化工程提交論文日期墊鰻生§目1 2 目論文答辯日期2 Q 豎生魚旦S 日答辯委員會主席 ．

4、昱丞盞 論文評閱人蕉筮盔! 遞周進學位授予日期二o o 六年五月A b s t r a c tT h i s s t u d y u s e d R e d r e c o m b i n a t i o n s y s t e m t o m o d i f y E s c h e r i c h i a c o l iB L 2 1 ( D E 3 ) ，ap o p u l a rp r o t e i np r o d u c

5、t i o ns t r a i n ．Am u t a n tE ．c o l i B L 2 I ( D E 3 ) w i t hi n a c t i v a t e dl p x Ma n dam o d i f i e dE ．c o l ip r o t e i np r o d u c t i o n s t r a i n w i t hc a p a b l eo fa u t o h u d r o l y s i

6、 n g h o s t n u c l e i c a c i d w e r e c o n s t r u c t e d i n o r d e r t o r e d u c e L P Sc o n t a m i n a t i o na n d n u c l e i ca c i dc o n t a m i n a t i o n i nt h ee x p r e s s e dp r o t e i na n d

7、 d e c r e a s et h ev i s c o s i t yo f c e l ll y s a t e sw h i c h i sc a u s e db yh i g hm o l e c u l a rw e i g h tc h r o m o s o m a lD N A o f t h e h o s t c e l l ．1 、M u t a t i o n si nt h el p x M g e n

8、ep r o d u c e a l o w e n d o t o x i c i t yl i p o p o l y s a c c h a r i d e ．H a v i n g c o n s t r u c t e da t a r g e t i n g v e c t o r w i t h a b o u t5 0 0 b p l o n g a i ' n a sh o m o l o g o u st O

9、l p x M , k a n a m y c i n r e s i s t a n c eg e n e w a s i n s e r t e d i nb e t w e e n t h e t w o r e g i o n s ．T h e r e p l a c e m e n t f r a g m e n t w a s e l e c t r o p o r a t e di n t oa r e c i p i e

10、 n t s t r a i ne x p r e s s i n gt h eh i g h l y p r o f i c i e n th o m o l o g o u sr e c o m b i n a n t s y s t e me n c o d e d b y p l a s m i dp K O B E G A f t e r t a r g e tg e n e w a s i n s e r t e db yt

11、 h e k a n a m y c i n g e n e ，t h er e s i s t a n c eg e n ew a s t h e n e l i m i n a t e db y u s i n g p C P 2 0 e n c o d i n g t h eF L P r e c o m b i n a s e ．T w oP C R p r o c e d u r e s w a s u s e d t oc

12、o n f i r m t h e l p x M g e n e w a s i n a c t i v a t e d b yi n s e r t i o na n d S D S —P A G E W a s a p p l i e d t oa n a l y s eL P S a n d p r o t e i n e x p r e s s i o n ，A c c o r d i n g t oe l e c t r o

13、 p h o s i sp a t t e r n ，L P Se x t r a c t e d f r o mt h e m u t a n t B L 2 1 s t r a i nW a s d i f f e r e n tf r o mo n e f r o m t h e o r i g i n a ls t r a i n ．T h em u t a n t E c o l i B L 2 1 ( D E 3 )h a

14、d t h e s a m e c a p a c i t y t os u p p o r t t h e p r o d u c t i o no f r e c o m b i n a n t p r o t e i n sa st h eo r i g i n a ls t r a i n ．T h i ss t u d y p r o v i d e sa v i a b l ek n o c k —i n s i t ei

15、nE ．c o l iB L 2 1 ( D E 3 )a n d T h e m u t a n t E ．c o l iB L 2 1 ( D E 3 ) s t r a i n w i t h i n a c t i v a t e d l p x M g e n e c o u l d b eu s e f u l t op r o d u c e r e c o m b i n a n tp r o t e i n sw i

16、t h r e d u c i n gt h e r i s kl i n k e d w i t hl o wl e v e lo f e n d o t o x i n c o n t a m i n a t i o n ．2 、H i g h m o l e c u l a r w e i g h tc h r o m o s o m a l D N A i sr e s p o n s i b l e b o t h f o r

17、 t h e v i s c o s i t yo f c e l ll y s a t e s ，a n di t i sa s o u r c e o fh e t e r o l o g o u sD N A s e q u e n c e s w h o s ei n c l u s i o n i nt h e f i n a l p r o d u c t m u s tb e p r e v e n t e d ．T or