2023年全國(guó)碩士研究生考試考研英語(yǔ)一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁(yè)
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1、質(zhì)粒是一種共價(jià)閉合環(huán)狀雙鏈DNA,廣泛存在于微生物中,是不同于基因組且獨(dú)立于基因組之外的DNA??梢宰灾鲝?fù)制,其大小由幾kb到幾百kb不等。質(zhì)粒在基因工程中的用途廣泛,有著重要的作用。實(shí)驗(yàn)室常用的質(zhì)粒通常包含復(fù)制子,抗性基因,多克隆酶切位點(diǎn)等原件。復(fù)制子決定了質(zhì)粒在宿主菌中的拷貝數(shù),抗性基因是一種篩選標(biāo)記,多克隆位點(diǎn)上含有多種核酸酶酶切位點(diǎn),可以方便外源基因片段的插入,從而有利于外源基因的克隆及表達(dá)。但是,質(zhì)粒對(duì)宿主菌的蛋白表達(dá)譜會(huì)產(chǎn)生

2、何種影響,目前還不是很清楚。因此本實(shí)驗(yàn)就實(shí)驗(yàn)室中保存的常用質(zhì)粒為研究對(duì)象,以大腸桿菌為宿主細(xì)菌,探討哪些質(zhì)粒載體會(huì)對(duì)宿主菌產(chǎn)生哪些具有重要意義的影響。
  由于大腸桿菌具有清楚的遺傳背景,生長(zhǎng)周期短,生長(zhǎng)速度快,安全性好,操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn),是工業(yè)生產(chǎn)和科研的常用宿主菌。隨著蛋白組學(xué)的發(fā)展,測(cè)定大腸桿菌表達(dá)的全部蛋白質(zhì)成為了可能。因此本實(shí)驗(yàn)擬利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù),研究實(shí)驗(yàn)室常見(jiàn)的質(zhì)粒載體對(duì)大腸桿菌全菌蛋白表達(dá)譜變化的影響。本實(shí)驗(yàn)所選用的

3、質(zhì)粒有自殺性質(zhì)粒pXL275,克隆載體pACYC184、pEASY-T3、pUC19、pAK,表達(dá)載體pPROEX HTB,結(jié)合輔助質(zhì)粒pRK2013等,所選用的宿主菌是MG1655,后者是經(jīng)典的大腸桿菌K-12系列菌株。自殺性質(zhì)粒、克隆質(zhì)粒、表達(dá)質(zhì)粒通過(guò)電轉(zhuǎn)入大腸桿菌MG1655,而結(jié)合輔助質(zhì)粒pRK2013較大,不能通過(guò)普通的質(zhì)粒提取和電轉(zhuǎn)方式導(dǎo)入大腸桿菌,故借助誘動(dòng)轉(zhuǎn)移的手段導(dǎo)入MG1655,目的菌株均通過(guò)相應(yīng)抗性篩選獲得。

4、>  導(dǎo)入外界質(zhì)粒的大腸桿菌通過(guò)雙向電泳檢測(cè)發(fā)現(xiàn):pXL275、pUC19、pAK、pPROEX HTB、pRK2013、pACYC184均不會(huì)引起大腸桿菌全菌蛋白譜的顯著變化,而質(zhì)粒pEASY-T3則引起大腸桿菌表達(dá)譜明顯的變化。我們對(duì)具有顯著差異的蛋白點(diǎn)進(jìn)行了生物質(zhì)譜分析,共鑒定到了33個(gè)蛋白點(diǎn)。其中pEASY-T3對(duì)大腸桿菌的蛋白表達(dá)產(chǎn)生的影響有(1)蛋白表達(dá)量缺失:磷酸戊糖變位酶,基因名為deoB;谷氨酸脫羧酶A,基因名為gad

5、A;蘋果酸合酶A,基因名為aceB;γ-氨基丁醛脫氫酶,基因名為prr;二肽轉(zhuǎn)運(yùn)子,基因名為dppA;超滲透誘導(dǎo)周質(zhì)蛋白,基因名為osmY;通用應(yīng)激蛋白,基因名為uspG;壓力響應(yīng)蛋白,基因名為hdeA;酸抗性蛋白,基因名為hdeB;保守蛋白YgiW,基因名為ygiW。(2)蛋白表達(dá)量明顯下調(diào):異檸檬酸裂解酶,基因名為aceA;甘油激酶,基因名為glpK;塔格糖-1,6-二磷酸醛縮酶,基因名為gatZ;二氫硫辛酰轉(zhuǎn)琥珀酰酶,基因名為su

6、cB;乙醛脫氫酶B,基因名為aldB;烯?;??;d體蛋白還原酶,基因名為fabI;乙二醛酶,基因名為hchA;鐵結(jié)合和貯藏蛋白,基因名為dps。(3)蛋白表達(dá)量明顯上調(diào):β-半乳糖苷酶,基因名為lacZ(載體質(zhì)?;蚓幋a)、β-內(nèi)酰胺酶,基因名為ampC(質(zhì)粒載體編碼)。
  根據(jù)pUC19和pEASY-T3質(zhì)粒圖譜的不同,我們克隆了f1片段,并與pUC19重組,構(gòu)建重組載體pUC19-f1,電轉(zhuǎn)至大腸桿菌構(gòu)建菌MG1655/p

7、UC19-f1。MG1655/pUC19-f1雙向電泳和MG1655/pUC19經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后雙向電泳顯示兩菌GadA的表達(dá)下調(diào),提示LacZ和f1片段對(duì)GadA的表達(dá)有影響,然而具體機(jī)制還需要探索。
  總結(jié):質(zhì)譜鑒定結(jié)果表明,質(zhì)粒pEASY-T3抑制了MG1655的10種基因的表達(dá),造成了蛋白的缺失表達(dá)。8種蛋白表達(dá)量明顯下調(diào),2種蛋白表達(dá)量明顯上調(diào)。在pEASY-T3直接抑制的10種基因中,與酸抗性相關(guān)基因gadA是目前研

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