glp-1（7-36）nh2的促胰島素分泌作用和胞內(nèi)camp濃度改變與胰島素mrna表達(dá)

1、 !』 !J { !差! !Q；(2mu l db ei n v o l v e di nt h i sp r o c e s s ．KE YWOR DS ： h y p o x i a ； s p l e e n ； T— l y mp h o c y t e ； a d e n o s i n e2 l 7G L P ． 1 ( 7 ． 3 6 ) N H 2 的促胰島素分泌作用和胞 內(nèi)c A MP濃度改變與胰島素 m R N A表

2、達(dá) 劉素芳 ， 陳屏 ， 許繼 田， 王清勇， 姚運(yùn) 緯( 1 ． 鄭州大學(xué) 醫(yī)學(xué) 院生理 學(xué)教研室 ， 河 l 萄 鄭州 4 5 0 0 5 2 ； 2 ． 水利部黃河 中心醫(yī)院功 能科 ， 河南 鄭州 4 5 0 0 0 3 )摘要 目的： 觀察G L P ． 1 ( 7 - 3 6 ) N H 2 的促胰島素分泌作用， 并進(jìn)一步探討 G I ． P - 1 ( 7 - 3 6 ) N H 2 促進(jìn)胰島素分泌的機(jī)制。方法： 放射

3、免疫分 析和細(xì)胞原位雜交的方法。結(jié)果： 隨著G L P ． 1 ( 7 - 3 6 ) N H 2 濃度的增加 ， 胰島素分泌逐漸增加； 8 - B r - c A MP 增加了胰島素分泌， G L P - 1 ( 7 —3 6 ) N H 2 則增加了胞內(nèi)第二信使 c a MP的濃度； G L P ． 1 ( 7 - 3 6 ) N H 2 可增加胰島素 m R N A的表達(dá)。結(jié)論： G L P - 1 ( 7 - 3 6 )可促進(jìn)胰

4、島素 分泌． 在一 定范圍內(nèi)呈劑量依賴性 ， 其機(jī)制與 G L P - 1 ( 7 - 3 6 ) N H 2 增加胞內(nèi)第二信 使 c a mp 和促進(jìn)胰 島素基 因表達(dá) 有關(guān)。關(guān)鍵詞：胰高血糖素樣肽；胰島素；分泌； 環(huán)磷酸腺苷 K E YWO R D S ： G L P 一 1 ( 7 — 3 6 ) N H2 ； i n s u l i n ； s e c r e t i o n ； c A b I P中圖分類號 ： R 3 3 5

5、文獻(xiàn)標(biāo)識碼 ： A文章編號 ： 1 0 0 0 — 6 8 3 4 ( 2 0 0 4 ) 0 3 ． 0 2 1 7 — 0 2胰高血糖素樣肽一 l ( g l u c a g o n ． 1 i k ep e p t i d e — l ， G L P 一 1 ) 是由空腸 、 回腸、 結(jié)腸的 I細(xì)胞分泌的胃腸道激素， 其由前胰高血 糖 素原轉(zhuǎn)化而來 ， G L P — l 被 酶解 末 端酰 胺化 后 ， 即生 成 有活 性的 G

6、 L P 一 1 ( 7 - 3 6 ) N H 2 。(P 一 1 ( 7 - 3 6 ) N H ， 可促進(jìn)胰島素分 泌， 但關(guān)于其促胰島素分泌的機(jī)制， 目 前 國內(nèi)研究尚少。本 實(shí)驗(yàn)利用 G L P ． 1 ( 7 ． 3 6 ) N H 2 作用于離體培養(yǎng)的大鼠胰島細(xì) 胞， 觀察 G IP — l ( 7 — 3 6 ) N H 2 的促胰 島素分泌作用 ， 并進(jìn)一步探討 G L P ． 1 ( 7 - 3 6 ) N I -

7、i 2 促進(jìn)胰島素分泌的機(jī)制。1 材料與方法 1 ． 1 試劑 R P MI 一 1 6 4 0 培 養(yǎng)基 ( G i b c o ) ， 胰 蛋 白酶 ( G i b c o ) ， G L P — l( 7 ． 3 6 ) N H 2 ( S i g m a ) ，8 - B r — c A MP ( S ~ g m a ) ， V 型膠 原 酶 ( S i g —m a ) ， 胎牛血清( 北方生物制劑廠) ， 胰島素放免測定試劑

8、盒 和環(huán) 磷酸腺苷 ( c A M P ) 測 定試 劑 盒 ( 中 國原 子能 科學(xué) 院 同位 素研究所) ， 胰島素 m RN A原位雜交試劑盒( 1 ~ t e r ) 。1 ． 2 胰 島細(xì)胞培養(yǎng) 胰島的分離參照王玲?等的方法， 取新生 3 ～5dS D大 鼠 l 0只( 本校動(dòng) 物實(shí) 驗(yàn) 中心 提 供 ) ， 無 菌 條 件下 剖腹 取 出胰 腺， 眼科剪反復(fù)剪切， 濃度為 l g ／ L的 V型膠原酶 3 7 ℃恒溫 水浴振

9、蕩消化 3 0mi n ， H a n k s 液低速離心清洗 ， 加入完 全 R P MI ． 1 6 4 0 培養(yǎng) 基( 含 l 0 ％胎 牛血清 ， 青 霉素 1 0 00 0 0U ／ 1，鏈 霉素 1 0 0m g ／ L， p H7 ． 4 ) ， 于 3 7 ℃ ， 5 ％ c o 2 ， 9 5 ％空氣 條 件下培養(yǎng) 2 0h 后， 接種于 9 6孔培養(yǎng)板 ， 保持每孔 2 0 0t * l 培養(yǎng) 液含胰島數(shù)為( 2 0

10、 ± 3 ) 個(gè) ， 培養(yǎng) 2 4h ， 按要求進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。1 ． 3 胰 島素和 c A MP放射 免疫 測定 采用競爭放射免疫分析法。胰島素或 “ c A M P抗體先與未 標(biāo)記胰島素或 c A M P充分反應(yīng)， 形成抗原抗體復(fù)合物， 剩余的未結(jié)合的胰島素或 c A MP 抗體再與 I 標(biāo)記的胰島素或 H 標(biāo) 記的 c A M P充分結(jié)合形成標(biāo)記抗原抗體復(fù)合物， 在 3 7 ℃溫育 2h， 使競爭反應(yīng)達(dá)到一定的平衡， 加入

11、分離試劑或活性炭， 室溫溫育 1 5m i n， 離心分離未結(jié)合的 I 一 胰島素或 H— c A MP和樣品( 或標(biāo)準(zhǔn)品) 中的胰島素或 t， 棄去上清液， 在 y 計(jì)數(shù) 器或 G 液體閃爍計(jì)數(shù)器上測定沉淀物 m u n t s ／ m i n 數(shù)。1 ． 4 胰島素 m R N A原位雜 交 離心收集培養(yǎng)的胰島細(xì)胞， 按試劑盒說 明實(shí)驗(yàn) ， 陽性信 號為胞漿 著色( 棕黃) 。高清晰度病 理圖文 分析系統(tǒng) ( h i g hp a

12、 t h o l o g i c a li m a g ea n a l y s i ss y s t e m，H P I A S) 量化分析胞漿著 色 的平 均光密 度( me x ~ i io p t i c a ld e r k s i t i e s ， M0 D ) 。1 ． 5 實(shí)驗(yàn) 分組 1 ． 51G L P — l ( 7 - 3 6 ) N H 2 對胰島素分泌的影響 對照組： 培 養(yǎng)液中不加 G L P — l (

13、 7 — 3 6 ) N H 2 ； 實(shí)驗(yàn)組分 5 組 ： 培養(yǎng)液 中加入 G L P ． 1 ( 7 — 3 6 ) N H ， 使其終 濃度 ( n m o l ／ L ) 分別 為 2 ． 5 、 5 ． 0 、1 0 ， 0 、 2 0 、 0 、 4 0 ， 0 。每組 6孔， 培養(yǎng) 2 4h 后 ， 放射免疫分析法 測定 上清液胰 島素 含量。l ， 5 ， 28 一 B r ． c A M P對 胰 島 素分 泌 的影 響

14、 對照 組 ： 培養(yǎng) 液 中不 含 8 一 B r ． c A M P ； 實(shí) 驗(yàn) 組 ： 培 養(yǎng) 液 中含 0 ． 1m m o l ／ L8 - B r -c A MP 。每組 6 孔 ， 放射免疫分析法測定上清液胰島素含量。l ， 53G L P ． 1 ( 7 - 3 6 ) N H 2 對胞 內(nèi) c A MP的 影響 對 照組 ： 培 養(yǎng)液 中不加 G L P - l ( 7 — 3 6 ) N H 2 ； 實(shí)驗(yàn)組 ： 培養(yǎng)

15、液 中含 2 0n mo l ／LG L P — l ( 7 — 3 6 ) N H 2 。每組 6 孔 ， 培養(yǎng) 2 4h 后 ， 放射免疫分析 法測定 胞 內(nèi) c A MP的含量 。1 ． 5 ． 4G L P — l ( 7 - 3 6 ) N H 2 對胰島素 m R N A表達(dá)的影響 對 照組 ： 培養(yǎng) 液 中不 含 G L P - l ( 7 — 3 6 ) N H 2 ； 實(shí)驗(yàn) 組 ： 培 養(yǎng)液 中含 2 0n mo l

16、／ LG L P — l ( 7 — 3 6 ) N H ' 。培養(yǎng) 2 4h 后 ， 取 出培養(yǎng)瓶 中的 胰 島團(tuán) ， 用 0 ． 2 5 ％胰 蛋 白酶 3 7 ℃ 消化 5m l n ， 離心 收集細(xì) 胞 ，涂片， 一 2 0 ℃保存 ， 以備胰島細(xì)胞原位雜交實(shí)驗(yàn)。1 ． 6 統(tǒng)計(jì) 處理 實(shí)驗(yàn)結(jié)果均用均數(shù) ± 標(biāo)準(zhǔn)差(±) 表示， 根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求 分別采用多個(gè)樣本均數(shù) 比較的方差分析方法和兩獨(dú)立樣本 均數(shù)

17、比較的 t 檢驗(yàn)。2結(jié)果 2 ． 1G L P · 1 ( 7 - 3 6 ) N H 2 對胰 島素分泌 的影 響 以 2 ． 5z l n x ~ l ／ L 、 5 ． 0n n ~／ 1、 1 0 ． 0n m o l ／ L 、 2 0 ． 0n r r d／ 14 0 ． 0n n ~／ L的 G L P - I ( 7 ． 3 6 ) N l 4 e 作用于離體胰島團(tuán)2 4h 后 ，維普資訊 http://www

18、.cqvip.com 2 l 8胰島素 分泌量 分別為 ( m l U ／ l) 6 8 ． 7 6 ±I J ． 7 l 、 7 23 0 ±1 3 ． 1 3 、1 0 4 ． 1 6 ±1 5 ． 5 7 、 I l 0 ． 9 8 ±7 ． 2 9、 l l 1 ． 5 8 ±1 0 ． 6 5 ， 與正常對 照組 ( 5 5 ． 5 3 ± 5 ． 6 3 ) 相比

19、， 有顯著性差異 ( P < 00 5 ， 表 1 ) 。T a b ． 1E f f e c t so fGIP1 ( 7 — 3 6 )H 2o ni n s u l i n~ r e t i o n ( (±S=6 )GL P - l ( 7 ． 3 6 ) N H， ( n mo l ／ L)I n s u l i ns e c r e t i o n( mI U／ L )02 ． 55． 0l 0． 02 0

20、． 04 0． 05 5 ． 5 3± 5． 6 36 8． 7 6± l 1 ． 7l7 2． 3 0± I 3 ． 1 31 0 4． 1 6± l 5 ． 5 7l l 0． 9 8± 7． 2 9l l 1 ． 5 8± l 0． 6 5P< 0． 0 5 ' U S0n mo l ／ L2 ． 28 - B r - e A M P對胰 島素分 泌的影響

21、對照組 2 4h 胰 島素分 泌量與實(shí)驗(yàn)組 問 2 4h 胰島素分 泌量差異有顯著性( P<0 ． 0 5 ， 表 2 ) 。Ta b． 2E f f e ct so f8 ． B r ． C A^ 伊 o ni n s u l i ns e c r e t i o n( j±， ，=6 )G r o u pI n s u l i ns e c r e t i o n ( ml U／ L)C o n t r o lEx

22、p e r i me n t5 2． 6 0± l 9． 7 7l 1 7． 0 3±5 0． 0 4P< 0． 0 57 3 5 “ c o n t r o l2 ． 3G L P ． 1 ( 7 - 3 6 ) N H 2 對胞 內(nèi) e M M P的影 響 對照組胰島細(xì)胞 內(nèi) c A MP含量 與實(shí)驗(yàn) 組兩 組相 比差異 有顯著性( P <0 ． 0 1 ， 表 3 ) 。T a b ． 3E f f

23、 e c t so fG L P ． 1 ( 7 - 3 6 ) N H 2o ni n t r a c e l l u l a rc A MP ( 孟±s )P< 0． 0 17 3 5 “ c o n t r o l2 ． 4G L P - 1 ( 7 - 3 6 ) N i t 2 對 胰島素 m R N A表達(dá)的影響 光學(xué)顯微鏡下觀察， 對照組胞漿著色多為黃色或淺黃，實(shí)驗(yàn)組胞漿著色多為深黃或棕黃 ， 經(jīng) H P

24、I A S 系統(tǒng)定量分析 ，對照組 2 7 6 個(gè)胰島 B細(xì)胞著 色的 MO D為 0 ． 0 7 4 4 ± 0 ． 0 1 7 9 ，實(shí)驗(yàn)組 3 0 4 個(gè)胰島 B細(xì)胞著色的 MO D為 0 ． 2 4 0 4 ± 0 ． 0 3 3 7 ，兩組細(xì)胞 M O D值相比差異有顯著性( P< 0 ． 0 1 ) 。3 討論 近年來 ， 胃腸激素的研究取得 了前所未有的進(jìn)展， 胃腸 道可分泌許多胃腸肽類激素調(diào)節(jié)胰

25、腺的活動(dòng)。L細(xì)胞屬于 胃 腸道內(nèi) A P U D細(xì)胞 ， 其可分泌胰高血糖素樣肽 ， 胰高血糖 素樣肽屬于胰高血糖素家族 ， 它們與胰高血糖素在序列上有 2 1 ％～4 8 ％ 的同 源性 。該 家族 中還包 括 G I ． P 一 2 ， G I P ， E x —C h h 1IA D O 1P h v s i o 12 0 0 4； 2 0 ( 3t e n d i4 等 盡管該家族成員來自于同一前體前胰高血糖 素原 ， 但是它

26、們的生理功能卻不同。胰高血糖素主要是升高 血糖 ， G IP1 則和胰島 素的分泌有關(guān) J 。本研究結(jié) 果 表明 ， 隨 著 G L P — l ( 7 — 3 6 )H 2 濃 度 的增加 ，2 4h 胰 島素分泌量逐漸增多 ， 實(shí)驗(yàn)各組 與對照組胰 島素分泌 量 比較均有明顯 差異( P<0 ． 0 5 ) ， 說明 G IP ． 1 ( 7 。 3 6 ) N H 2 具 有促胰島素分泌效應(yīng)。G IP — l ( 7 -

27、3 6 ) N H 2 促進(jìn)胰島素分泌是 通過和 B細(xì)胞膜上的 G蛋白偶聯(lián)受體結(jié)合而發(fā)揮作用， 隨著 實(shí)驗(yàn) 中G L P — l ( 7 — 3 6 ) N H ， 濃度的增加， 與受體結(jié)合的數(shù)量增 多 ， 因此 表現(xiàn)出一定濃度 范圍內(nèi) G L P — l ( 7 — 3 6 ) N H ， 呈劑量依 賴 性 的促進(jìn)胰 島索分泌作用 。8 一 B r — c A MP( 8 - b r o mo - c y c l i c3’ ， 5

28、’ 一 a d e n o s i n emo n o p h o s —p h a t s ， 8 - 溴一 環(huán)磷酸腺苷) 是一種嘌呤環(huán) 8 ～ 碳位修飾的 c a m P類似物， 可以穿透細(xì)胞膜 ， 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示， 8 一 B rc A M P實(shí)驗(yàn)組 2 4h 胰 島素分泌量較對照組增加 了 2 倍 ， 提 示在 胰島 素分泌 機(jī)制中， 有 c , ~ V l P的參與。實(shí)驗(yàn)中觀察到實(shí)驗(yàn)組胞內(nèi) c A M P 含量 較 對 照組

29、增 加 ， 說 明 G L P ． 1 ( 7 ． 3 6 ) N H 2 可 能通 過 胞 內(nèi)c A MP促進(jìn)胰島素分泌。該過程可能與 G L P — l ( 7 — 3 6 ) N H 2 作 用于細(xì)胞膜上 G L P ． 1 ( 7 ． 3 6 ) N H ， 受體有關(guān) ， 該受體屬于 G蛋 白偶聯(lián)受體超家族的一個(gè) 6 4K D a 蛋白， G L P — l ( 7 ． 3 6 ) N H 1 通 過與其受體結(jié)合進(jìn)而激活了細(xì)胞膜

30、上的 G蛋白偶聯(lián)的腺苷 酸環(huán)化酶， 使 A T P 轉(zhuǎn)化為 c a mp ， c a mp 作為第二信使， 增加 了胰 島素分泌 。實(shí)驗(yàn)組胰島素 m R N A原位雜交細(xì)胞著色的平均光密度 值 較對照組 明顯增 加 ， 表 明 G L P — l ( 7 - 3 6 ) N H 2 可 以上 調(diào)胰 島素 mR N A的表達(dá)。該過程可能與 c A M P作用于胞 內(nèi) C R E ，從基因水平促進(jìn)胰島素的合成有關(guān)。但也有證據(jù)表明與 c A

31、MP 可能增加 了胰島素基因的翻譯過程或是增加了胰島素 m R N A的穩(wěn)定性有關(guān)l。4 參 考 文獻(xiàn) [ 1 ]王 玲 ， 方海立 ， 楊英魁 ， 等 ．白細(xì)胞介素， 18 對新生 大鼠胰島素分泌作用及其機(jī)制分析[ J ] ． 中國應(yīng)用生理學(xué)雜志 ， 1 9 9 5 ， 11 ：5。 7．【 2 ] Q u d d u s iS ， V a h l TP ， H a n s o n K， e ta 1 ． D i f f e r e

32、n t i a le f f e c t s o fa —c u t ea n de x t e n d e di n f u s i o n so fg l u c a g o n s— l i k ep e p t i d e 一 1o nf i r s ta n ds e c o n dp h a s ei n s u l i ns e c r e t i o ni nd i a b e t e sa ndn o n r d i

33、a b e t i ch u ，m a n~ [ J ] ． D i a b e t e sC a r e ， 2 0 0 3 ， 2 6 ( 3 ) ： 7 9 1 ， 7 9 8 ．[ 3 ]R i t z e lR ， S c h u l t eM， N a u c kM A ． G l u c a g o n —l i k ep e p t i d e1i n rc r e a ~ s ． ~c r e t o r yb u

34、r s tma s so fp u l s a t i l ei n s u l i ns e c r e t i o ni np a t i e n t sw i t ht y p e2d i a b e t e sa ndi m p a i r e dg l u c o s et o l e r a n c e [ J ] ． D i a b e t e s ，2 0 0 1 ， 5 0： 7 7 6 — 7 8 4 ．1 4JP

35、h i l i p p eJ ， Mi x ~ o t t e nM． F I J n c t i o n a lc h a r a c t e r i z a t i o no fac A MP ，r e s p o n s ee l e m e n to ft h er a ti n s u l i nIg e n e [ J ] ． JB i o lC hl ， 1 9 9 0 ，2 6 5 ： 1 4 6 51 4 6 9 ．*