基于prtP編碼的細胞膜絲氨酸蛋白酶lactocepin對副干酪乳桿菌免疫調(diào)節(jié)的影響.pdf

1、乳酸菌可以與腸道粘膜免疫系統(tǒng)相互作用，在抑制腸道致病菌、調(diào)節(jié)機體免疫功能、維持腸道微生態(tài)平衡等方面發(fā)揮重要作用。而乳酸菌發(fā)揮益生作用的前提是其與腸上皮細胞的粘附，粘附作用是菌株定植腸道的第一步。乳酸菌對腸道上皮細胞的粘附作用有助于其在腸道定植、增強乳酸菌與腸道細胞之間的交流、抑制病原菌在腸道的定植和提高機體免疫力。因而乳酸菌的粘附性是評價其作為益生菌的重要指標。最新研究發(fā)現(xiàn)，在乳酸乳球菌中，細胞外膜的絲氨酸蛋白酶lactocepin除了

2、有水解蛋白質(zhì)、抗炎等功能外，還能介導(dǎo)乳酸菌的粘附作用，主要是通過影響范德華力的改變。
　　為了研究lactocepin是否介導(dǎo)乳酸菌的粘附，本文以副干酪乳桿菌為載體，用九-Red重組系統(tǒng)敲除lactocepin的編碼基因prtP，構(gòu)建副干酪乳桿菌lactocepin缺失突變株。并比較了突變株與親本株在生物學(xué)特性、體內(nèi)外粘附性以及對腸道免疫影響等的差異。主要的結(jié)果如下:
　　比較副干酪乳桿菌親本株與lactocepin缺失突變

3、株菌的生長曲線、表面疏水性、自凝聚能力、抑制致病菌的能力及藥敏性。結(jié)果表明，lactocepin缺失，副干酪乳桿菌生長速度減慢，疏水性和自凝聚能力顯著下降，抑菌能力無明顯變化，對不同抗生素的敏感性有所改變。副干酪乳桿菌親本株對諾氟沙星、環(huán)丙沙星、多粘菌素B、鏈霉素均具有耐藥性;對四環(huán)素和青霉素G中度敏感;對利福平、頭孢唑林和頭孢拉定均敏感，而lactocepin缺失突變株菌突變株對諾氟沙星、多粘菌素B和鏈霉素均有耐藥性;對環(huán)丙沙星、青霉

4、素G和頭孢拉定中度敏感;對利福平、四環(huán)素、頭孢唑林均敏感。
　　本研究還測定了副干酪乳桿菌親本株與lactocepin缺失突變株對小鼠巨噬細胞、脾臟細胞、腸上皮細胞以及腸黏液的粘附能力，建立了四種體外粘附模型。實驗采取了鏡檢法、涂板法測乳酸菌對細胞的粘附性，熒光標記法測乳酸菌的體內(nèi)粘附數(shù)。結(jié)果顯示，lactocepin影響乳酸菌對不同細胞粘附性。在巨噬細胞上，親本株粘附的數(shù)量為27.7±2.52個，lactocepin缺失突變株粘

5、附的數(shù)量是19.3±3.06個，明顯高于脾臟細胞的19.3±2.08個、10.7±1.53個和小腸上皮細胞的14.7±1.53個、8.3±1.53個，且親本株對三種細胞的粘附量均顯著高于突變株。親本株對小鼠小腸黏液的粘附率為20.07±0.18％，突變株的粘附率為16.96±0.82％，親本株顯著高于突變株(P＜0.01)。
　　本試驗采用流式細胞儀分析了兩株受試乳酸菌在小鼠腸道中的定植與分布。結(jié)果表明，親本株與突變株在腸道中的定

6、植情況不相同。突變株在腸道的定植主要發(fā)生在灌胃前期，回腸和結(jié)腸中都是在第1d定植量最多，十二指腸和空腸中都是在第3d定植得最多。親本株在腸道的定植除在結(jié)腸是第一天定植量最多以外，都發(fā)生在灌胃后期。親本株和突變株主要都是定植在結(jié)腸，十二指腸中最少。在不同腸段，親本株的粘附量均顯著高于突變株(P＜0.01)。
　　采用CBA技術(shù)通過體內(nèi)、外實驗研究了受試乳酸菌對免疫器官、免疫細胞和免疫分子的影響。結(jié)果表明，發(fā)現(xiàn)親本株與突變株都能在灌胃

7、的中期提高小鼠的免疫器官指數(shù)，后期不明顯;均能提高脾臟淋巴細胞轉(zhuǎn)化率，但親本株比突變株更顯著;親本株能顯著提高巨噬細胞能量水平和吞噬能力(P＜0.05)，突變株作用不顯著。親本株和突變株高劑量時均可以增加機體對IFN-α的表達量（P＜0.01），親本株的表達效果更顯著，親本株可以增加機體對IL-10的表達量(P＜0.01)，而突變株的作用效果不明顯。親本株可以增加機體對IFN-γ的表達量，且與劑量及時間有關(guān)，高劑量作用顯著(P＜0.05