瑪咖化學成分分析及其神經(jīng)保護作用機制研究.pdf

1、瑪咖是十字花科獨行菜屬草本植物，被盛譽為“秘魯人參”，目前我國云南，新疆，西藏等地區(qū)引種成功，市場瑪咖產(chǎn)品種類繁多，由于其產(chǎn)地及品種的不同，且產(chǎn)品多圍繞其壯陽功效予以夸大宣傳，導致市場混亂，魚龍混雜，長遠來看，將會極大影響瑪咖產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。早期主要研究集中其初生代謝產(chǎn)物。近年來發(fā)現(xiàn)瑪咖越來越多的其它生理作用，對其次生代謝產(chǎn)物如瑪咖酰胺、瑪咖烯、芥子油苷等及其藥理作用研究逐漸增多。本論文系統(tǒng)闡述了瑪咖的化學成分并對其體內(nèi)外神經(jīng)保護作用及

2、其作用機制進行了初步探討。
　　一.瑪咖化學成分分離
　　本研究首先對瑪咖成分進行了基本系統(tǒng)分離，分離鑒定了23個化合物，包括12個生物堿類（7個瑪咖酰胺類生物堿，2個吡啶類生物堿，1個咔啉類生物堿，2個普通酰胺類生物堿），3個芥子油苷類，4個有機酸類，4個其他類化合物，所分離鑒定的23個化合物中6個在本植物中為首次發(fā)現(xiàn)。
　　二.瑪咖化學成分分析
　　建立了用以分析瑪咖中次生代謝產(chǎn)物的UHPLC-ESI-Orb

3、itrap MS分析方法，總結了瑪咖酰胺，吡啶類、咔啉類、咪唑類生物堿、芥子油苷、瑪咖烯的多級質(zhì)譜裂解規(guī)律（吡啶類和咔啉類生物堿的裂解規(guī)律是首次推導），并運用上述裂解規(guī)律鑒定了瑪咖中的159個化合物。為使峰增加且不同類有效成分富集，瑪咖甲醇提取物通過ODS柱分為6個組分（Fr1-Fr6）進行鑒定和推導，包括64個瑪咖酰胺類、3個吡啶類、38個咪唑類、16個咔啉類生物堿、14個芥子油苷類、11個瑪咖烯類、5個有機酸類和8個其他類化合物。<

4、br>　　建立了利用液相串聯(lián)三重四級桿質(zhì)譜(UHPLC-ESI-QqQ MS)定量分析瑪咖中的活性成分，運用動態(tài)多反應離子監(jiān)測(DMRM)技術定量17個不同產(chǎn)地，不同類型和不同部位的瑪咖中14個代表性化合物（甲氧基芐基芥子油苷、芐基芥子油苷、對羥基芐基芥子油苷、N-(3-甲氧基芐基)-十六碳酰胺、N-芐基苯甲酰胺、N-芐基十六碳酰胺、甘草查爾酮、1，2-二氫-4-甲醛-3-苯甲基-N-羥基吡啶、4-甲醛-3-甲氧基芐基-N-吡啶、N-乙

5、酰芐胺、苯乙酰胺、煙酸、琥珀酸、(1R，3S)-1-甲基-β-咔啉-3-甲醛。芥子油苷類(10.97～79.84 mg/g)和生物堿類(0.54～2.99 mg/g)是瑪咖中的主要成分，并分析比較了國內(nèi)引種和國外秘魯原產(chǎn)地，國內(nèi)產(chǎn)地之間，不同品種及不同部位的差異，表明原產(chǎn)地和國內(nèi)引種產(chǎn)地的瑪咖有效成分含量是有差別的，芥子油苷類和咔啉類生物堿在秘魯瑪咖樣品中的含量高于在中國種植的瑪咖。然而，在中國種植的瑪咖中有機酸類，吡啶類生物堿，普通酰

6、胺類生物堿和瑪咖酰胺的含量是高于在秘魯原產(chǎn)地種植的。結果表明云南種植的瑪咖為成為秘魯原產(chǎn)地可能的替代品提供了依據(jù)，國內(nèi)不同產(chǎn)地之間云南產(chǎn)的瑪咖次生代謝產(chǎn)物的含量較西藏和新疆地區(qū)的多;對于不同品種的瑪咖，經(jīng)過我們的實驗發(fā)現(xiàn)黃瑪咖和紫瑪咖的次生代謝產(chǎn)物含量類似，遠不及市場上宣傳的那樣質(zhì)量有顯著性差異，對于過度宣傳的質(zhì)量差異有待進一步研究;對于植株不同部位的瑪咖，瑪咖根中的有效成分是顯著高于葉中的，這可能與瑪咖的生物合成途徑有關，且葉中也有一

7、定含量的芥子油苷類和瑪咖酰胺類生物堿，為擴大瑪咖資源利用奠定了基礎。
　　三.瑪咖神經(jīng)保護作用研究
　　本實驗采用MPTP誘導斑馬魚神經(jīng)損傷模型研究不同組分及單體的神經(jīng)保護作用，總提取物顯示有神經(jīng)保護作用，F(xiàn)r4（普通酰胺生物堿，吡啶生物堿），F(xiàn)r5（咪唑生物堿，瑪卡酰胺，瑪咖烯），F(xiàn)r6（瑪咖酰胺）有不同程度的神經(jīng)保護作用且具有劑量依賴性，尤其是80％乙醇洗脫部位。結合瑪咖化學成分分析，F(xiàn)r5和Fr6部位都含有高含量的N-

8、芐基十六碳酰胺(A54)。N-芐基十六碳酰胺且作為單體化合物顯示有顯著地神經(jīng)保護作用且有劑量依賴性。采用乙酰膽堿酯酶和丁酰膽堿酯酶抑制實驗進行了體外驗證，這些發(fā)現(xiàn)表明瑪咖是通過多巴胺能系統(tǒng)和膽堿能系統(tǒng)之間的協(xié)同作用顯示神經(jīng)保護作用的?，斂窠?jīng)保護作用的機制之一可能是提高腦內(nèi)乙酰膽堿和丁酰膽堿的水平， N-芐基十六碳酰胺作為單體體內(nèi)體外均驗證了具有神經(jīng)保護作用，說明瑪咖酰胺類化合物確實是瑪咖起神經(jīng)保護作用的主要化合物類型。
　　為了

9、探討N-芐基十六碳酰胺作用于MPTP誘導的MN9D細胞的保護作用，本研究采用MPP+損傷MN9D細胞建立神經(jīng)損傷體外模型，研究N-芐基十六碳酰胺的保護作用，篩選MPP+作用于MN9D細胞的合適造模濃度為500μM，起到神經(jīng)保護作用的N-芐基十六碳酰胺的合適濃度范圍為50-100μM。500μMMPP+作用MN9D細胞24 h，細胞的存活率降低至約50％，從細胞顯微鏡下也可以看到細胞形態(tài)的變化，對照組MN9D細胞大部分貼壁，大部分細胞有突

10、起生長，且逐步向外延伸，模型組500μMMPP+作用MN9D細胞24h后，細胞貼壁數(shù)目較少，突起消失，因此選擇此濃度作為本研究的造模濃度; N-芐基十六碳酰胺濃度為100μM時可顯著減輕MPP+造成的MN9D神經(jīng)元細胞損傷，倒置顯微鏡下觀察與模型組比較，N-芐基十六碳酰胺給藥組顯示貼壁數(shù)目增多，大部分細胞有突起生長恢復，且逐步向外延伸。說明N-芐基十六碳酰胺對MPTP誘導的MN9D小鼠多巴胺能神經(jīng)元損傷細胞具有保護作用。
　　利用

11、UHPLC-ESI-QqQ MS測定N-芐基十六碳酰胺作用于MPP+誘導的MN9D細胞損傷前后神經(jīng)遞質(zhì)的含量變化，分別絕對定量和相對定量了細胞上清液和細胞中的12種和17種神經(jīng)遞質(zhì)，造模后下降，給予N-芐基十六碳酰胺48h后又回升的神經(jīng)遞質(zhì)細胞上清液中主要有谷氨酸，牛磺酸，去甲腎上腺素，膽堿，乙酰膽堿，丁酰膽堿且這些氨基酸類、單胺類和膽堿類神經(jīng)遞質(zhì)呈劑量依賴性關系。細胞中主要有谷氨酸，去甲腎上腺素，丁酰膽堿，天冬氨酸，高香草酸也呈劑量依

12、賴性關系。而對于細胞上清液中的5-羥色胺及細胞中的5-羥色胺和精氨酸呈現(xiàn)模型后上升給藥后又下降的趨勢，而N-芐基十六碳酰胺對其余的神經(jīng)遞質(zhì)調(diào)節(jié)作用則不明顯。由此可知細胞上清液和細胞中谷氨酸，去甲腎上腺素和丁酰膽堿在N-芐基十六碳酰胺給藥后同時都具有顯著性差異且具有劑量依賴性，尤其是膽堿類神經(jīng)遞質(zhì)，推測機制N-芐基十六碳酰胺能升高乙酰膽堿和丁酰膽堿的水平與第二部分內(nèi)容結果相呼應，有可能通過膽堿能系統(tǒng)來調(diào)節(jié)多巴胺能系統(tǒng)，從而起到神經(jīng)保護作用

13、。
　　運用LTQ-Orbitrap MS分析了N-芐基十六碳酰胺干預MPP+損傷MN9D細胞中的差異表達蛋白。結果顯示給模型藥后降低給藥后升高且呈劑量依賴性關系的差異蛋白有142個，給模型藥后升高給藥后降低且呈劑量依賴性關系的差異蛋白有209個，且在Mev.4.9.0軟件分析后ANOVA統(tǒng)計檢驗P小于0.01后，4組共有的差異蛋白60個，使用uniprot數(shù)據(jù)庫對其進行功能注釋且根據(jù)豐度高的篩選出34個差異蛋白，參與細胞過程的蛋

14、白所占比例較大，KEGG數(shù)據(jù)庫顯示其參與細胞自噬，NF-κB信號通路，Toll樣受體信號通路，MAPK信號通路，EGFR酪氨酸酶抑制劑抗性，p53信號通路，細胞程序性凋亡等信號通路，說明N-芐基十六碳酰胺的神經(jīng)保護作用靶點通路與細胞過程炎癥相關。
　　基于UPLC-Q-TOF系統(tǒng)建立了N-芐基十六碳酰胺對MPP+神經(jīng)損傷的MN9D細胞的脂質(zhì)代謝組學研究方法，將所得數(shù)據(jù)導入SIMCA-P13.0軟件進行正交偏最小二乘法判別分析(OP

15、LS-DA)，根據(jù)每組數(shù)據(jù)的RSD值需大于30％，同時從中挑選出VIP＞1.5的代謝物離子，并經(jīng)過t檢驗，P＜0.05認為差異有統(tǒng)計學意義，篩選出與MPP+神經(jīng)損傷相關且N-芐基十六碳酰胺藥物治療后的差異脂質(zhì)代謝物。正常組找出111個差異性脂質(zhì)分子，模型組組找出114個差異性脂質(zhì)分子，給藥組找出115個差異性脂質(zhì)分子，3組共有的差異性脂質(zhì)分子有108個，結果顯示，MPP+神經(jīng)損傷可能與甘油磷脂酰膽堿(PC)，磷脂酰乙醇胺(PE)，鞘磷脂

16、(SM)，磷脂酸(PA)，甘油三酯類(TG)代謝密切相關。
　　綜上所述，瑪咖次生代謝產(chǎn)物主要有瑪咖酰胺，吡啶類生物堿，咔啉類生物堿，咪唑類生物堿，芥子油苷和瑪咖烯等。其中瑪咖酰胺是瑪咖起神經(jīng)保護作用的主要化合物類型，一方面可能通過提高腦內(nèi)谷氨酸、乙酰膽堿、丁酰膽堿、去甲腎上腺素等神經(jīng)遞質(zhì)的水平，另一方面通過調(diào)節(jié)某些差異脂質(zhì)分子和蛋白質(zhì)發(fā)揮此作用，具有明顯生物學意義的差異蛋白質(zhì)和脂質(zhì)分子仍需進一步進行相關驗證，找出N-芐基十六碳酰