酶偶聯(lián)法催化還原潛手性酮類化合物的研究.pdf

1、醛酮還原酶作為催化劑制備手性化合物時，合成產(chǎn)物的同時會消耗掉一定量的輔酶。而這些輔酶往往比所制備的產(chǎn)物還要昂貴，穩(wěn)定性差，難以重復(fù)利用。在工業(yè)化生產(chǎn)中，不可能投加大量的輔酶，所以高效輔酶再生系統(tǒng)的構(gòu)建和輔酶的反復(fù)使用是當(dāng)下必須解決的問題。
　　為了解決輔酶再生問題，本文利用基因工程的方法，以洛德酵母的基因組為模板，經(jīng)過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增得到甲酸脫氫酶(FDH)基因，與載體pET28a成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒pFDH-pET28

2、a，并轉(zhuǎn)化入E.coli BL21(DE3)中，得到重組菌E.coli BL21-FDH。分別考察了溫度，濃度和時長對此蛋白酶可溶性表達(dá)的影響，并測得甲酸脫氫酶的酶活。
　　利用構(gòu)建的高效輔酶再生系統(tǒng)，制備兩種醫(yī)藥中間體:L-2-氨基丁酸和(S)-1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇。
　　分別構(gòu)建了蘇氨酸脫氨酶(TD)表達(dá)質(zhì)粒pTD-pET28a和亮氨酸脫氫酶(LDH)表達(dá)質(zhì)粒pLDH-pET21a。將pTD-pET28a

3、轉(zhuǎn)化入E.coli BL21(DE3)中，得到重組菌E.coliBL21-TD，測得蘇氨酸脫氨酶的酶活。將重組質(zhì)粒pFDH-pET28與pLDH-pET21a共同轉(zhuǎn)化入E.coli BL21(DE3)中，得到重組菌E.coli BL21-FDH/LDH。測得亮氨酸脫氫酶的酶活。利用酶偶聯(lián)法制備L-2-氨基丁酸，探索并確定了此轉(zhuǎn)化反應(yīng)的最適條件:溫度、pH、氧化型輔酶Ⅰ(NAD+)的初始濃度、最大底物投料量、酶加量配比和最終反應(yīng)時長等。同

4、時探索并確定了L-2-氨基丁酸的最佳純化條件:溫度、pH和醇洗次數(shù)等。質(zhì)譜(MS)，核磁(NMR)和旋光檢測證明此反應(yīng)催化得到的產(chǎn)物為L-2-氨基丁酸。最終產(chǎn)物純度為97％，收率為80.65％，已達(dá)到后續(xù)實驗的要求。
　　構(gòu)建了乙醇脫氫酶(ADH)表達(dá)質(zhì)粒pADH-pET21a，與pFDH-pET28a共同轉(zhuǎn)化入E.coli BL21(DE3)中，得到重組菌E.coli BL21-FDH/ADH。測得乙醇脫氫酶的酶活。利用酶偶聯(lián)法

5、制備(S)-1-（2，6-二氯-3-氟苯基）乙醇，探索并確定了轉(zhuǎn)化反應(yīng)的最適條件:溫度、pH、最大底物投料量、最佳助溶劑和最終反應(yīng)時長等。采用柱層析法純化產(chǎn)物。質(zhì)譜，核磁和旋光檢測證明此反應(yīng)催化得到的產(chǎn)物為(S)-1-（2，6-二氯-3-氟苯基）乙醇。最終產(chǎn)物純度為100％，收率為50％以上，已達(dá)到后續(xù)實驗的要求。
　　通過L-2-氨基丁酸和(S)-1-（2，6-二氯-3-氟苯基）乙醇的制備，表明本文中構(gòu)建的輔酶再生系統(tǒng)的有效性。