KAT2A對二氧化鈦納米管形貌促進(jìn)頜骨骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的作用研究.pdf

1、研究背景：
　　生物醫(yī)學(xué)材料的性能強烈依賴于第一個發(fā)生相互作用時，材料表面接觸的生物環(huán)境[1]；同時。在骨組織工程種子細(xì)胞發(fā)揮功能和分化過程中，由于骨頭本身最基本的結(jié)構(gòu)層次納米范圍內(nèi)，而納米級別材料可以通過人體仿生來精確控制[2,3]，因此，種子細(xì)胞與納米級別材料的研究受到人們研究和應(yīng)用的青睞。在口腔臨床治療應(yīng)用領(lǐng)域，種植體材料是最為常見的生物材料之一，用于牙齒缺失和骨組織缺損的修復(fù)[4]；對于種植體的表面的處理技術(shù)，研究所和企業(yè)

2、也在不斷探索和改進(jìn)。
　　我們已知表觀遺傳學(xué)和微環(huán)境的改變有著密切的聯(lián)系[5]，而種植體材料表面的形貌也為細(xì)胞的粘附、生長、增殖、分化提供了一個微環(huán)境，這兩者存在的聯(lián)系值得我們更為深入的研究。2012年葉玲等[6]研究顯示組蛋白去甲基化轉(zhuǎn)移酶KDM4B和KDM6B促進(jìn)人間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化。2015年周永勝等[7]研究表明二氧化鈦納米管通過上調(diào)啟動子區(qū)域里成骨基因Runx2和OCN的組蛋白H3K4甲基化水平以及抑制去甲基化的RBP

3、2表達(dá)，從而促進(jìn)脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化。
　　然而對于表觀遺傳乙酰轉(zhuǎn)移酶在TiO2納米管形貌與頜骨骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化過程中發(fā)揮的作用還未做相關(guān)的報道。因此，明確表觀遺傳學(xué)在納米形貌與干細(xì)胞之間的相互作用有利于我們對口腔修復(fù)材料與細(xì)胞作用機制有著更加深入的認(rèn)識，并為患者的臨床治療選擇提供新的思路。
　　研究目的：
　　通過觀察體外實驗研究表觀遺傳酶對TiO2納米管形貌與JMMSCs成骨分化作用的影響，探究表觀

4、遺傳學(xué)在對種植體表面形態(tài)生物學(xué)性能是否起到作用，以及如何在種植體表面微觀形態(tài)與在頜骨骨髓干細(xì)胞成骨方向上作用的內(nèi)在機制，從而為種植體表面電化學(xué)處理技術(shù)提供相應(yīng)的理論支持，為改善種植體骨結(jié)合能力提供新的研究方向，同時為表觀遺傳酶在種植體修復(fù)中骨結(jié)合作用途徑提供一定的依據(jù)。
　　方法：
　　1、JMMSCs分離、純化、培養(yǎng)及鑒定
　　通過體外組織塊培養(yǎng)法和有限稀釋法培養(yǎng)頜骨來源骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(JMMSCs)；流式細(xì)胞儀檢

5、測細(xì)胞表面特定標(biāo)記；噻唑藍(lán)（ methylthiazolyl tetrazolium,MTT）檢測干細(xì)胞增殖能力；成骨、成脂分化誘導(dǎo)檢測干細(xì)胞多向分化能力。
　　2、TiO2納米管形貌對JMMSCs成骨分化能力的影響
　　利用電化學(xué)陽極氧化的方法制備均勻有序的TiO2納米管（NTs），通過掃描電子顯微鏡（SEM）進(jìn)行材料表面形態(tài)的觀察，以確定納米級微觀形貌的獲??；電鏡下觀察TiO2納米管上JMMSCs形態(tài)，通過Cell co

6、unt8(CCK-8)法檢測與TiO2納米管共培養(yǎng)的JMMSCs自我增殖能力；成骨誘導(dǎo)后通過茜素紅染色比較研究TiO2納米管對JMMSCs成骨分化的作用。
　　3、表觀遺傳酶在TiO2納米管形貌對JMMSCs成骨分化方向上的影響
　　先是通過NTs與JMMSCs的體外共培養(yǎng)，利用qRT-PCR的方法在不同時間點下篩選出特異性表達(dá)的表觀遺傳酶，應(yīng)用小干擾RNA對篩選出來的特定基因的進(jìn)行干擾，通過兩種方式：一種是應(yīng)用小干擾 RN

7、A后的與 NTs共培養(yǎng)的JMMSCs進(jìn)行常規(guī)成骨分化誘導(dǎo)7d、14d，對其進(jìn)行堿性磷酸酶（ALP）的染色；一種是應(yīng)用小干擾RNA后與NTs共培養(yǎng)的JMMSCs進(jìn)行常規(guī)成骨分化誘導(dǎo)14d后對細(xì)胞的成骨基因的表達(dá)進(jìn)行qRT-PCR的檢測，探討特定基因干擾后JMMSCs成骨分化能力的變化。
　　4、統(tǒng)計學(xué)分析
　　所有數(shù)據(jù)采用SPSS17.0軟件系統(tǒng)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。兩組間比較使用兩樣本t檢驗；多組間比較采用單因素方差分析。計量資料

8、采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，以雙側(cè)P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　實驗結(jié)果：
　　1、所有樣本都能成功獲得原代JMMSCs；細(xì)胞在顯微鏡下呈長梭形；流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果表明JMMSCs中間充質(zhì)干細(xì)胞表面特定標(biāo)記（CD105、CD90）均為陽性表達(dá)，而造血干細(xì)胞表面特定標(biāo)記（CD34、CD14、CD45）均為陰性表達(dá)；MTT實驗結(jié)果表明JMMSCs具有自我增殖能力；成骨分化誘導(dǎo)檢測可見到鈣化結(jié)節(jié)沉積，成脂分化誘導(dǎo)檢測可見脂滴形

9、成。結(jié)果說明，JMMSCs具有干細(xì)胞多向分化的潛能。
　　2、利用陽極氧化法在一定濃度的電解溶液的條件下，掃描電子顯微鏡（SEM）觀察材料成功制備出TiO2納米管形貌，通過CCK8試劑盒檢測發(fā)現(xiàn)TiO2納米管對JMMSCs的增殖能力有一定的促進(jìn)作用，成骨誘導(dǎo)28d以后茜素紅結(jié)果顯示NTs組的對 JMMSCs的成骨分化能力促進(jìn)作用更顯著。結(jié)果說明，TiO2納米管形貌具有促進(jìn)JMMSCs的成骨分化的作用。
　　3、根據(jù)qRT-P

10、CR在3d、7d檢測乙?；D(zhuǎn)移酶基因表達(dá)結(jié)果，綜合對比分析得出，在乙?；D(zhuǎn)移酶家族中KAT2A在TiO2納米管與JMMSCs共培養(yǎng)過程中特異性的表達(dá)；應(yīng)用小干擾 RNA后，相比于未干擾組，干擾組 NTs上的JMMSCs的成骨基因ALP、COL-1、OCN表達(dá)相應(yīng)的出現(xiàn)下調(diào)；同時堿性磷酸酶染色結(jié)果表示，干擾后與NTs共培養(yǎng)的JMMSCs相比不干擾組成骨分化能力下降。結(jié)果說明，KAT2A在納米管形貌促進(jìn)JMMSCs成骨分化能力起著關(guān)鍵作用。