水母雪蓮SmTTG1基因的克隆及表達(dá)研究.pdf

1、水母雪蓮（Saussurea medusa Maxim.），又稱水母雪兔子，屬菊科風(fēng)毛菊屬，是一種生長于青藏高原地區(qū)的珍稀、瀕危藥用植物。同時(shí)，它又是一種典型的高山植物。植株密被表皮毛是水母雪蓮最具有代表性的形態(tài)特征，它是水母雪蓮對(duì)極端環(huán)境的一種適應(yīng)結(jié)構(gòu)。研究水母雪蓮表皮毛的形成和發(fā)育過程，對(duì)揭示高山植物適應(yīng)環(huán)境的特殊機(jī)制將具有重要的理論意義。為此，本研究以水母雪蓮作為實(shí)驗(yàn)材料，通過 RT-PCR，結(jié)合 RACE技術(shù)，克隆了與表皮毛發(fā)育

2、相關(guān)的基因TTG1，并研究了該基因的表達(dá)。
　　主要研究結(jié)果如下：
　　1.克隆到的水母雪蓮TTG1基因全長1346 bp，其中包括1014 bp的開放閱讀框，99 bp的5’端非編碼區(qū)，211 bp的3’端非編碼區(qū)，22 bp的ploy（A）尾巴。該基因共編碼337個(gè)氨基酸殘基，分子量為37.75 KD，等電點(diǎn)為4.88。同源比對(duì)顯示，水母雪蓮TTG1基因的核苷酸序列與同一科植物大麗花TTG1基因的核苷酸序列的同源性為75

3、％；推導(dǎo)出來的氨基酸序列與大麗花的同源性為83%，與擬南芥、煙草的同源性為74.56%、73.98%。通過SOPMA工具預(yù)測(cè)，水母雪蓮TTG1蛋白包含18.69%的α-螺旋，10.09%的β-轉(zhuǎn)角，43.03%的無規(guī)卷曲，28.19%的延伸鏈。無規(guī)卷曲和延伸鏈為該蛋白的主要二級(jí)結(jié)構(gòu)。水母雪蓮TTG1基因的氨基酸序列有五個(gè)WD40 repeat，說明該基因可能編碼一種WD40蛋白，將該基因命名為SmTTG1（genbank accessi

4、on number:KX447632）。
　　2.采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)，檢測(cè)β-actin、18SrRNA、GAPDH、EF和TUA五個(gè)基因在水母雪蓮根、莖、葉、花中的表達(dá)情況，運(yùn)用geNorm、NormFinder和Bestkeeper三個(gè)軟件分析這5個(gè)基因在這4種組織內(nèi)表達(dá)的穩(wěn)定性。結(jié)果顯示，在根、莖、葉、花中表達(dá)最穩(wěn)定的是18SrRNA。因此，18SrRNA可以作為水母雪蓮qRT-PCR的校正內(nèi)參基因

5、。
　　3.以18SrRNA作為內(nèi)參基因，運(yùn)用qRT-PCR技術(shù)，測(cè)定SmTTG1在根、莖、葉、花中的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，SmTTG1基因在4種組織中都有表達(dá)，其中在葉和花中的表達(dá)量最高。
　　4.將SmTTG1基因連接到pColdⅠDNA表達(dá)載體，并導(dǎo)入BL21（DE3）大腸桿菌中進(jìn)行原核表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物用 SDS-PAGE電泳分析。結(jié)果顯示，目的蛋白在大腸桿菌中表達(dá)，表達(dá)蛋白的分子量大約是38KD，與由核苷酸序列推導(dǎo)的目的