釩、鋅配合物選擇性抑制PTP1B及其細胞效應研究.pdf

1、蛋白酪氨酸磷酸酶（PTPs）是生物體內(nèi)細胞信號轉(zhuǎn)導過程中發(fā)揮重要作用的一類酶，它能夠特異性去除蛋白酪氨酸殘基上的磷酸基團，從而廣泛影響細胞生長、分化、遷移、凋亡和免疫應答等過程。蛋白酪氨酸磷酸酶1B（PTP1B）是第一個被發(fā)現(xiàn)和純化的PTP酶，它通過對胰島素受體及其底物的酪氨酸殘基去磷酸化，從而對胰島素信號轉(zhuǎn)導過程進行負調(diào)控。研究表明敲除PTP1B基因的小鼠對胰島素的敏感性和葡萄糖的耐受性都明顯增強并且正常生長。目前PTP1B被公認為是

2、研發(fā)治療Ⅱ型糖尿病藥物的作用靶點。
　　釩配合物具有類胰島素的作用，并且已經(jīng)在糖尿病的治療中表現(xiàn)出了一定的效果。研究表明釩配合物的類胰島素作用與其對PTP1B的抑制有關?；阝C配合物VIVO(nbbb)(H2O)2(1)和VIVO(bpmp)2(3)能夠高效且選擇性抑制體外重組PTP1B的實驗結(jié)果[1]，本論文進一步研究了釩配合物1和3對細胞內(nèi)PTP1B的選擇性抑制作用及其對細胞活性和細胞凋亡的影響，測定了細胞中釩配合物的含量，并

3、初步探究了釩配合物誘導細胞凋亡的途徑。
　　鋅是生物體內(nèi)僅次于鐵、含量第二豐富的微量金屬元素，具有胰島素樣活性。鋅配合物也可能是有效的PTP1B抑制劑。本文研究了五種新型鋅配合物對PTP1B的選擇性抑制作用。
　　論文主要工作和研究結(jié)果如下：
　　1、運用蛋白免疫印跡法檢測了釩配合物1和3作用于人乳腺癌細胞(MCF7)和肝癌細胞(HepG2)后PTP1B底物磷酸化水平的變化，進而探究釩配合物對PTP1B的抑制作用。結(jié)果

4、表明釩配合物1和3能有效地抑制細胞內(nèi)PTP1B的活性，其中釩配合物1抑制PTP1B的選擇性較好，這與體外酶活性實驗結(jié)果一致。
　　2、運用MTT比色法檢測釩配合物1和3在抑制細胞內(nèi)PTP1B活性的同時對細胞活力造成的影響。結(jié)果表明配合物1和3作用于兩種細胞后均會使細胞存活率減少，并且與時間和濃度呈依賴關系。與配合物3相比，釩配合物1對細胞活性影響較小，有較低的細胞毒性，尤其是在MCF7細胞中細胞存活率高達86％。
　　運用流

5、式細胞術(shù)和Annexin V-PI雙染法研究了釩配合物1和3對MCF7細胞凋亡的影響。結(jié)果表明釩配合物1和3能誘導MCF7細胞凋亡，并且配合物影響細胞活性和誘導細胞凋亡的實驗結(jié)果呈線性關系，表明這兩個釩配合物是通過誘導細胞凋亡從而影響細胞活性的，而不是直接導致細胞壞死。
　　釩配合物1和3作用于不同的細胞后對細胞內(nèi)磷酸化、細胞活力和細胞凋亡產(chǎn)生了不同的影響，這可能與釩配合物進入細胞內(nèi)的含量有關。本論文通過ICP-MS測定了釩配合物

6、作用后，MCF7和HepG2細胞內(nèi)釩的含量。結(jié)果表明釩配合物1和3都能很好的進入細胞，有較好的脂溶性和細胞通透性。其中配合物1由于空間結(jié)構(gòu)較小，比配合物3更容易進入細胞。此外，盡管VOSO4在細胞內(nèi)也能夠有效抑制PTP1B的活性，但是VOSO4作為一種無機鹽，它不能很好的穿透細胞膜，生物利用度比較差。
　　3、由于PTPs能廣泛影響細胞的生長和凋亡過程，所以釩配合物誘導細胞凋亡可能與其對PTPs的抑制作用有關。文獻報道部分金屬配合

7、物作為蛋白酶體抑制劑，能夠通過抑制細胞內(nèi)蛋白酶體的活性從而誘導細胞凋亡。本論文通過研究釩配合物1和3對蛋白酶體活性的影響，初步探究了釩配合物誘導細胞凋亡的途徑。結(jié)果表明釩配合物1和3作用于MCF7細胞后促進了細胞內(nèi)蛋白酶體的活性，說明釩配合物并不是通過抑制蛋白酶體的活性，而可能是通過抑制PTPs的活性從而誘導細胞凋亡的。配合物1和3對未經(jīng)處理的MCF7細胞提取物中蛋白酶體的活性基本沒有影響，說明釩配合物在細胞內(nèi)并不是直接作用于蛋白酶體增

8、強其活性的，而可能是由于釩配合物抑制PTPs的活性增強了其相關底物的磷酸化水平，從而影響蛋白酶體的上游靶標，誘導了蛋白酶體表達，使其活性增強。
　　釩配合物1在細胞內(nèi)能選擇性抑制PTP1B的活性，有較低的細胞毒性、良好的細胞通透性，有望成為新型的II型糖尿病治療藥物。
　　4、以多苯并咪唑為配體，合成了鋅配合物6-10，并研究了其對PTP1B的選擇性抑制作用，實驗結(jié)果表明這五種鋅配合物都能有效抑制PTP1B的活性，但是對PT

9、P-MEG2和SHP-1抑制較弱，幾乎不抑制SHP-2。TCPTP是與PTP1B高度同源的一種酶，配合物7和9對TCPTP的抑制作用明顯弱于配合物6、8、10，因而7和9對PTP1B表現(xiàn)出較好的選擇性。酶促動力學實驗結(jié)果表明7和9對PTP1B和TCPTP的抑制類型分別為競爭性和非競爭性，推測配合物的選擇性可能與其抑制方式有關。熒光滴定實驗結(jié)果表明配合物7和9與PTP1B的結(jié)合能力強于TCPTP，這與它們對這兩種酶的抑制能力一致。繼續(xù)深入