生物小分子與DNA相互作用的光譜及二維核磁的研究.pdf

1、癌癥是目前危及人類生命的最主要疾病之一，在當(dāng)今世界的疾病中，癌癥的致死率要占到25％左右?？茖W(xué)家歷經(jīng)數(shù)代人的艱辛努力，正花很大力氣來攻克這個(gè)危害人類健康的堡壘。目前治療癌癥普遍使用兩種方法:一種是化學(xué)療法;另一種是放射元素治療;簡稱化療和放療。在化療的過程中幾乎所有的抗癌藥物在殺傷癌細(xì)胞的同時(shí)也殺傷正常細(xì)胞。同樣，放療也會(huì)因?yàn)榉派渚€在治療癌癥的同時(shí)給身體帶來一定的傷害。因此，提高抗癌藥物的選擇性、研制開發(fā)高效低毒的抗癌藥物就成為科學(xué)家們

2、關(guān)注的焦點(diǎn)。
　　對(duì)于治療癌癥我們還有第三種路徑可選擇，那就是從基因水平上治療。分子生物學(xué)和分子藥理學(xué)的發(fā)展使人們能夠從基因水平理解某些生命現(xiàn)象，并通過分子設(shè)計(jì)來尋找靈敏的核酸探針和有效的治療藥物。絕大多數(shù)抗癌劑在生物體內(nèi)的靶點(diǎn)是DNA分子，其作用方式大致分為三種:(1)藥物與模板DNA形成非共價(jià)復(fù)合物，主要與DNA以氫鍵相結(jié)合。當(dāng)雙鏈開始解離時(shí)，藥物也隨之從DNA上脫離。(2)藥物與模板DNA形成共價(jià)復(fù)合物，主要與DNA以共價(jià)鍵

3、相結(jié)合。若介于DNA的雙鏈之間，則在雙鏈之間形成交聯(lián)，從而妨礙DNA雙鏈的拆開。(3)選擇性地與DNA結(jié)合，DNA雙鏈結(jié)構(gòu)變得不穩(wěn)定，引起單鏈或雙鏈斷裂，降解模板DNA。由此可見，對(duì)DNA特定序列的斷裂，應(yīng)是抗癌劑高效殺滅癌細(xì)胞又保護(hù)正常細(xì)胞的主攻方向。
　　人類基因組序列的揭示，為DNA特定序列的斷裂提供了基礎(chǔ)。研究表明，作為基因載體的DNA在聚合酶的錯(cuò)誤復(fù)制、化學(xué)污染的侵襲、藥物的濫用及電磁輻射的損傷下會(huì)產(chǎn)生堿基錯(cuò)配，通常細(xì)胞

4、內(nèi)的修復(fù)系統(tǒng)會(huì)及時(shí)將其修復(fù)，可一旦修復(fù)不成功，堿基錯(cuò)配將導(dǎo)致子系DNA的誘變，引發(fā)各種分子病，例如癌癥等等。因此，作為分子病檢測(cè)診療技術(shù)基礎(chǔ)的DNA錯(cuò)配識(shí)別體系的開發(fā)和研究具有重要意義。由于小分子與核酸的鍵合能力非常強(qiáng)，而體積又小，易通過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，直接與核酸作用，所以國際上已有很多課題組在研究小分子對(duì)核酸的識(shí)別，已經(jīng)取得很大進(jìn)展。核酸識(shí)別體系與核酸的作用方式有共價(jià)鍵合與非共價(jià)鍵合，如抗癌藥物順鉑與核酸的作用為共價(jià)鍵合。而非共價(jià)

5、鍵合的識(shí)別體系又分為兩種，一種稱為溝鍵合劑，其形狀基本與核酸的大小溝互補(bǔ)，靠范德華力或與堿基形成氫鍵，在核酸的大溝或小溝處鍵合，如Distamycin，SN7167以及多胺類化合物;另一種稱為插入劑，通常含有異環(huán)甲面大配體，插入到核酸堿基對(duì)間，這種作用使得DNA的構(gòu)型發(fā)生很大變化，如抗癌藥物Nogalamycin（諾加霉素）以及本課題組和計(jì)亮年院士課題組一直研究的惰性金屬多吡啶類混配配合物。美國的Barton教授課題組曾合成了一種銠的配

6、合物[Rh(bpy)2(chrysi)]3+，該配合物以插入方式與DNA鍵合，對(duì)單堿基C∶C錯(cuò)配具有特異選擇性。伯明翰大學(xué)Hannon教授課題組又發(fā)現(xiàn)了一種新的藥物-核酸作用模式，即藥物在“三向連接DNA（3-way DNA junction）”的中心處鍵合，該工作已在Angewandte Chemie(2006 volume45 issue8 pages1227-31)上發(fā)表。著名的生物化學(xué)家Stephen Neidle多年來一直致力

7、于研究小分子對(duì)核酸的識(shí)別及抗癌藥物的設(shè)計(jì)，在其新著的《Nucleic Acid Structure and Recognition》中也詳細(xì)介紹了小分子對(duì)核酸的識(shí)別。我們課題組在研究中也發(fā)現(xiàn)了許多更有意義的切入點(diǎn)。特別值得提出的是，在所有的堿基錯(cuò)配中，剪式G∶A錯(cuò)配構(gòu)型多樣，是最難識(shí)別和修復(fù)的，已有的研究結(jié)果表明，含剪式G∶A錯(cuò)配的DNA比正常的B型DNA有較寬的小溝，而且核苷酸A從鏈內(nèi)滑移出來，與互補(bǔ)鏈的核苷酸A形成交聯(lián)堆積。因此本論

8、文著重于設(shè)計(jì)合成并篩選出幾種對(duì)G∶A錯(cuò)配具有特異選擇性的識(shí)別體系，并研究它們與這類寡聚核苷酸的精細(xì)、確切的作用情態(tài)。為分子病的檢測(cè)提供某些實(shí)驗(yàn)和理論依據(jù);
　　由于不同的錯(cuò)配對(duì)應(yīng)于不同的錯(cuò)配識(shí)別體系。DNA錯(cuò)配識(shí)別體系大都是一些含有芳香大環(huán)配體的手性金屬配合物。其相互作用有不少的難點(diǎn):其一，盡管核酸構(gòu)型的多樣性已逐漸被人們認(rèn)識(shí)，但由于研究方法的局限性，目前對(duì)這一領(lǐng)域的認(rèn)識(shí)還不完善、不系統(tǒng)、甚至不同的研究方法得出的結(jié)果也不同，因而對(duì)

9、它們的識(shí)別研究是十分復(fù)雜的;其二，由于體系的相互作用是在溶液中的動(dòng)態(tài)過程，通常是用光譜法研究它們與DNA或寡聚核苷酸的作用，而這種研究得出的直接信號(hào)是光譜的紅移紫移、增色減色，得到的是一些現(xiàn)象學(xué)的間接結(jié)果，很難確證;鑒于以上兩個(gè)原因，我們利用二維核磁的NOESY、TOCSY等圖譜對(duì)它們的作用進(jìn)行了研究。同時(shí)利用分子模擬，研究了構(gòu)成識(shí)別體系的金屬配合物與DNA相互作用的精細(xì)情態(tài)和規(guī)律，并揭示金屬配合物與核苷酸相互作用的規(guī)律。我們?cè)O(shè)計(jì)了兩處

10、含G∶A錯(cuò)配的十聚錯(cuò)配寡聚核苷酸d(CCGAATGAGG)2和正常的寡聚核苷酸d(CCTAATTAGG)2，并合成了三種金屬配合物[Co(phen)2(DPQ)]Cl3;[Co(phen)2(HPIP)]Cl3;[Co(phen)2(HNAIP)]Cl3，然后用這三種金屬配合物與正常d(CCTAATTAGG)2及錯(cuò)配寡聚核苷酸d(CCGAATGAGG)2的作用相對(duì)照，得出較滿意的結(jié)果。同時(shí)我們還發(fā)現(xiàn)了一些小分子體系能夠切割PBR322D

11、NA，一些金屬配合物能夠?qū)ξ赴┘?xì)胞株的活性具有很好的抑制效果。
　　基于以上的工作，我們概括如下:
　　1.我們首次發(fā)現(xiàn)6-芐氨基嘌呤可與Co2+、Ni2+形成穩(wěn)定配合物，它們的存在影響藥物分子與DNA之間的相互作用，本文從吸收光譜、熒光光譜、Scatchard圖等方面研究了6-芐氨基嘌呤及其金屬配合物與小牛胸腺DNA之間的相互作用，發(fā)現(xiàn)這些金屬配合物與DNA都存在靜電結(jié)合。同時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)8-氮雜腺嘌呤可與Co2+、Cu2+

12、形成穩(wěn)定配合物，用同樣方法我們發(fā)現(xiàn)，這些8-氮雜腺嘌呤的金屬配合物與DNA都存在嵌插結(jié)合。
　　2.我們發(fā)現(xiàn)現(xiàn)存的廣譜抗癌藥物（治療L1210、P388白血病，肉瘤SA180，淋巴瘤、乳腺癌、卵巢癌、胃癌，黑色素瘤B16，乳腺癌，路易斯肺癌以及結(jié)腸癌38等）——表柔比星可與Cu2+形成2∶5的穩(wěn)定體系，并且通過紫外光譜、熒光光譜、粘度實(shí)驗(yàn)、DNA熔點(diǎn)實(shí)驗(yàn)、電化學(xué)實(shí)驗(yàn)以及切割實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)表柔比星及表柔比星-Cu2+體系與DNA之間的作用

13、均為嵌插作用，同時(shí)表柔比星-Cu2+體系能在1.0×10-5mol·L-1濃度下將pBR322DNA切割出明顯的線性。
　　3.我們首次合成了二水楊醛三乙基四胺合鎂(Ⅱ)配合物并應(yīng)用紫外光譜、熒光光譜、粘度實(shí)驗(yàn)、DNA熔點(diǎn)實(shí)驗(yàn)、電化學(xué)實(shí)驗(yàn)以及切割實(shí)驗(yàn)對(duì)其與DNA的相互作用進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，該配合物與EB在DNA上的結(jié)合位點(diǎn)是非競(jìng)爭型的，同時(shí)發(fā)現(xiàn)該配合物能在較低濃度(10-6mol/L)下斷裂pBR322質(zhì)粒DNA，當(dāng)配合物濃度

14、達(dá)10×10-5 mol·L-1時(shí)，可將pBR322質(zhì)粒DNA切割為線性(formⅢ，linear帶)，說明該配合物具有較高的切割質(zhì)粒DNA的活性。而且我們推測(cè)，二水楊醛三乙基四胺合鎂(Ⅱ)配合物對(duì)質(zhì)粒DNA的作用很可能是水解切割，即其能較快地推動(dòng)pBR322DNA磷酸二酯鍵的水解。這一結(jié)果為開發(fā)新的人工核酸酶、從分子水平上探討配合物在藥物的開發(fā)和分子生物學(xué)中的應(yīng)用提供了有價(jià)值的信息。
　　4.我們合成了[Ru(phen)2tpp

15、hz](PF6)2·2H2O及[Co(phen)2tpphz]Cl(PF6)2·2H2O兩種配合物，并通過切割實(shí)驗(yàn)及細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)首次發(fā)現(xiàn)[Ru(phen)2tpphz](PF6)2·2H2O及[Co(phen)2tpphz]Cl(PF6)2·2H2O均可導(dǎo)致胃癌細(xì)胞活性不同程度的降低，1nM[Co(phen)2tpphz]Cl(PF6)2·2H2O可以使胃癌細(xì)胞株7901成活率降低22.2％;1μM[Co(phen)2tpphz]Cl(

16、PF6)2·2H2O可以使胃癌細(xì)胞株7901成活率降低30.6％。1nM[Ru(phen)2tpphz](PF6)2·2H2O可以使胃癌細(xì)胞株7901成活率降低25.2％;1μM[Ru(phen)2tpphz](PF6)2·2H2O可以使胃癌細(xì)胞株7901成活率降低48.6％。這一結(jié)果說明所合成的[Co(phen)2tpphz] Cl(PF6)2·2H2O及[Ru(phen)2tpphz](PF6)2·2H2O配合物對(duì)癌細(xì)胞有很好的抑制

17、作用。電泳實(shí)驗(yàn)表明它們均能在很低的濃度(5×10-6 mol·L-1)將pBR322 DNA切割為線性。
　　5.我們利用二維核磁研究了三種金屬配合物[Co(phen)2(HPIP)]Cl3;[Co(phen)2(HNAIP)]Cl3;[Co(phen)2(DPQ)]Cl3分別與錯(cuò)配d(CCGAATGAGG)2及正常d(CCTAATTAGG)2的十聚寡聚核苷酸的作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn):
　　對(duì)于配合物[Co(phen)2(HPIP)

18、]Cl3，在其與錯(cuò)配寡聚核苷酸作用的NOESY譜上，我們看出，由于NOE相關(guān)峰主要來自于錯(cuò)配G∶A附近區(qū)域的大溝質(zhì)子，例如相關(guān)峰T6H6/A5H2'的消失，相關(guān)峰A8H8/G7H4'的減小，都說明[Co(phen)2(HPIP)]3+從“大溝”插入到錯(cuò)配G∶A附近的堿基對(duì)，從而影響到附近堿基對(duì)的相關(guān)峰，近一步的指認(rèn)我們可以確定[Co(phen)2(HPIP)]3+插入到堿基對(duì)T6G7之間。[Co(phen)2(HPIP)]3+與正常寡聚

19、核苷酸作用的NOESY譜上，我們看出，[Co(phen)2(HPIP)]3+從小溝與正常寡聚核苷酸的端基作用。31P NMR表明配合物的加入沒有改變正常寡聚d(CCTAATTAGG)2的磷酸骨架。由分子模擬可以得知配合物[Co(phen)2HPIP]3+對(duì)正常及剪式錯(cuò)配DNA都具有識(shí)別作用，識(shí)別的過程體現(xiàn)了異構(gòu)體的選擇性、DNA溝的選擇性和位點(diǎn)特異性，在識(shí)別錯(cuò)配序列DNA的過程中手性選擇性不明顯，優(yōu)先選擇配合物結(jié)構(gòu)形式Ⅱ與DNA在T6G

20、7大溝發(fā)生作用;與正常DNA的相互作用優(yōu)先選擇配合物結(jié)構(gòu)形式Ⅰ，在小溝端基發(fā)生作用，同時(shí)右手異構(gòu)體會(huì)被富集。以上這些結(jié)果表明，分子模擬能夠與二維核磁實(shí)驗(yàn)很好的吻和。
　　對(duì)于[Co(phen)2(DPQ)]Cl3，在NOESY譜上，我們可以看到許多[Co(phen)2(DPQ)] Cl3與錯(cuò)配及正常寡聚核苷酸作用的NOE相關(guān)峰。對(duì)于錯(cuò)配寡聚核苷酸，NOE相關(guān)峰主要來自于端基G∶C質(zhì)子，我們判定配合物[Co(phen)2(DPQ)]

21、3+主要從小溝與G∶C區(qū)域作用，并且插入不深。對(duì)于正常寡聚核苷酸，數(shù)據(jù)表明[Co(phen)2(DPQ)]3+從小溝插入到堿基對(duì)T3/A4間。由于核苷酸G4和A5糖環(huán)上H4'與H5'/H5"共振的重疊，不可能清晰地歸屬為哪個(gè)核苷酸，但是出現(xiàn)的NOE相關(guān)峰表明配合物確實(shí)是插入鍵合。與這一插入模型相一致的是DPQ與大溝質(zhì)子T3CH3的NOE相關(guān)峰，表明DPQ體系從小溝橫跨堆積的堿基對(duì)而延伸到大溝里。31PNMR表明配合物的加入沒有使得DNA

22、的構(gòu)型發(fā)生顯著的改變。分子模擬結(jié)果顯示[Co(phen)2(DPQ)]3+與錯(cuò)配寡聚DNA d(CCGAATGAGG)2作用時(shí)，作用在小溝，端基，同時(shí)左手異構(gòu)體與錯(cuò)配寡聚的作用更加穩(wěn)定，能量更低，左手異構(gòu)體會(huì)被富集;與正常d(CCTAATTAGG)2寡聚核苷酸作用在小溝的T3A4區(qū)作用，同樣左手異構(gòu)體會(huì)被富集。這些結(jié)果與實(shí)驗(yàn)結(jié)果非常一致。
　　對(duì)于[Co(phen)2(HNAIP)]3+，在其與錯(cuò)配寡聚核苷酸作用的NOESY譜上，