條斑紫菜R-藻紅蛋白熒光標記抗體制備研究.pdf

1、R-藻紅蛋白熒光標記抗體是一種新型的熒光探針，具有傳統(tǒng)熒光物無法比擬的優(yōu)越性，可應用于熒光激活細胞分類、流式細胞儀熒光測定、熒光免疫檢測以及單分子檢測等多項技術，在醫(yī)學診斷、動植物檢疫、細胞生物學和分子生物學等諸多領域中得到應用。本論文主要從條斑紫菜R-藻紅蛋白提純、熒光標記抗體的制備、優(yōu)化以及檢測技術等方面進行了研究。主要研究內(nèi)容如下： 1.R-藻紅蛋白的純化與性質(zhì)鑒定本實驗按照自行建立的流程成功地從紫菜中提取低成本高純度的R

2、—PE，為下一步制備廉價的R-藻紅蛋白熒光標記物打下了基礎。并分別通過紫外光譜掃描、層析、電泳、結晶等方法對藻紅蛋白的性質(zhì)進行鑒定。 紫外分光光度計檢測證明所得R-藻紅蛋白吸收光譜為雙峰型且純度達到4.6以上；而層析及非變性電泳都顯示只有一個峰及一個條帶，表明純度已達到后續(xù)實驗要求；結晶實驗則表明：R-藻紅蛋白較適合結晶的pH大致在6.0左右，兩周后得到晶體，且在十周后仍未分解，所得晶體大小在0.02mm×0.02mm×0.1m

3、m左右，紅色，有折光現(xiàn)象，進一步說明所得R-藻紅蛋白的純度較高；用激發(fā)光分別照射載玻片和硝酸纖維素膜上的條斑紫菜R-藻紅蛋呈橙黃色熒光，其結果證明其熒光特性良好，可用于熒光標記檢測。 2.熒光標記物制備方法研究本實驗在確定所用實驗材料及對材料性質(zhì)鑒定的基礎上，通過對于三種不同的交聯(lián)試劑對于R-PE的影響及不同交聯(lián)方法的比較，以確定蛋白交聯(lián)的方法包括反應時間、試劑種類及濃度的控制及制備流程。 首先比較了不同濃度交聯(lián)試劑對藻

4、紅蛋白性質(zhì)及熒光強度的影響，發(fā)現(xiàn)戊二醛作用于R—PE較適合的濃度為0％-0.2％；高碘酸鈉作用于R—PE較適合的濃度為0-20mmol/L；而SPDP作用于R—PE較適合的摩爾比則為0-350。其次，分別選取0.2％的戊二醛、20mmol/L的高碘酸鈉與SPDP：R—PE為20進行交聯(lián)產(chǎn)物的制備與檢測。最后通過對于各自層析圖和電泳圖的比較，發(fā)現(xiàn)由于戊二醛使用量的難以確認及高碘酸鈉法易出現(xiàn)多聚合產(chǎn)物等原因，確定前兩種都不太適合用于R—PE

5、熒光標記物的制備。只有SPDP&DTT組合法較適合熒光抗體的制備，并初步確定了制備流程，即用異功能試劑SPDP活化R—PE，DTT疏基化抗體，經(jīng)透析法分別去除溶液中多余的SPDP和DTT后混合交聯(lián)反應，制備的熒光標記混合物過凝膠層析柱，獲得R—PE熒光標記的抗體。 3.R-藻紅蛋白熒光標記物制備條件優(yōu)化本實驗在上一章研究的基礎上，以自制的高純度條斑紫菜R—PE為材料，著重探討緩沖液pH及反應的溫度對于藻紅蛋白熒光性質(zhì)的影響、比較

6、了三種常用的蛋白濃縮法以及交聯(lián)試劑與物質(zhì)摩爾比對交聯(lián)效果的影響，對整個交聯(lián)過程進行了條件優(yōu)化和質(zhì)量跟蹤，旨在初步制備高純度R—PE熒光標記的第二抗(羊抗兔抗體)，為建立高質(zhì)量、低成本且簡便的熒光探針制備工藝奠定基礎。 首先，確定R-藻紅蛋白在交聯(lián)反應時最好在低溫(5℃左右)、避光條件下進行，而所選用的反應緩沖液的pH值以6.8為適宜。其次，在三種蛋白濃縮方法中以超濾法對R—PE蛋白性質(zhì)影響最小且回收率高，所以選用超濾離心管對蛋白

7、進行濃縮及脫鹽處理。最后通過一系列的比較實驗確定了R—PE與SPDP按摩爾比為1：40進行衍生化，同時以DTT與IgG摩爾比為500：1進行巰基化。經(jīng)交聯(lián)過柱分離后所得的交聯(lián)產(chǎn)物與原方法相比不僅大大降低了交聯(lián)過程中的反應物損失，而且顯著提高了交聯(lián)產(chǎn)率并已初步制成高純度產(chǎn)品。 4.R-藻紅蛋白熒光標記物的應用及免疫檢測技術在制備了高純度R-藻紅蛋白熒光標記的第二抗(羊抗兔抗體)的基礎上，分別通過以NC膜為載體的免疫檢測、單細胞鹽藻

8、中的定位實驗以及肝癌SMCC-7721細胞的檢測應用等免疫檢測手段以確定制得R-藻紅蛋白熒光標記抗體是否保持了良好的熒光性和特異性，為R—PE熒光探針的實際應用奠定基礎。并在確定R-藻紅蛋白熒光標記抗體的制備流程之后，初步探索藻藍蛋白(PC)熒光標記抗體的制備條件及以NC膜為載體進行免疫檢測。 通過以NC膜為載體的免疫檢測、單細胞鹽藻中的定位實驗以及肝癌SMCC-7721細胞的檢測應用等免疫檢測顯示對照組與檢測組區(qū)別明顯，證明了

9、經(jīng)優(yōu)化后所制備的R-藻紅蛋白熒光標記抗體不僅特異性保持了完好而且熒光強度大完全能用于細胞中的免疫檢測。特別是對于SMCC-7721細胞的檢測，在綠色熒光激發(fā)下紅色細胞形態(tài)清晰完整，說明R-藻紅蛋白熒光標記后的抗體能與一般腫瘤細胞發(fā)生特異性結合。 此外還基本建立了對于固相載體、懸浮細胞及貼壁細胞的熒光免疫檢測流程，初步確定在選用綠色濾光片檢測R-藻紅蛋白熒光標記物能更好地保證免疫檢測的效果。而藻藍蛋白(PC)熒光標記抗體制備與檢測