稀杯盔形珊瑚兩種抗氧化相關(guān)蛋白(Ferritin,CuZnSOD)的基因克隆及原核表達(dá).pdf

1、廣東海洋大學(xué)碩士學(xué)位論文稀杯盔形珊瑚兩種抗氧化相關(guān)蛋白(FerritinCuZnSOD)的基因克隆及原核表達(dá)范程輝指導(dǎo)教師：劉麗教授申請(qǐng)學(xué)位類別：理學(xué)專業(yè)名稱：海洋生物學(xué)研究方向：海洋經(jīng)濟(jì)動(dòng)物發(fā)育生物學(xué)學(xué)院名稱：水產(chǎn)學(xué)院中國(guó)湛江2014年6月分類號(hào)：Q781密級(jí)：公開(kāi)UDC：606學(xué)號(hào)：2111101101I稀杯盔形珊瑚兩種抗氧化相關(guān)蛋白(FerritinCuZnSOD)的基因克隆及原核表達(dá)摘要近年來(lái)由珊瑚白化現(xiàn)象導(dǎo)致的珊瑚生態(tài)系統(tǒng)失衡

2、問(wèn)題越來(lái)越嚴(yán)重，為了探究珊瑚本身對(duì)環(huán)境氧化脅迫的響應(yīng)機(jī)制，本研究克隆得到了稀杯盔形珊瑚兩種抗氧化相關(guān)蛋白（鐵蛋白和銅鋅超氧化物歧化酶）的基因cDNA全序列，對(duì)編碼的目的蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析，并在體外原核表達(dá)成功。主要研究結(jié)果如下：1.鐵蛋白基因研究結(jié)果（1）鐵蛋白基因cDNA全序列的克隆及序列分析利用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(reversetranionpolymerasechainreactionRTPCR)和cDNA末端快速擴(kuò)增法(r

3、apidamplificationofcDNAendsRACE)克隆獲得了稀杯盔形珊瑚鐵蛋白(Ferritin)的基因cDNA全序列，其長(zhǎng)度為906bp，5非編譯區(qū)(5UTR)為130bp，3非編譯區(qū)(3UTR)為257bp，開(kāi)放閱讀框(F)長(zhǎng)度為519bp，編碼172個(gè)氨基酸。Ferritin基因的5UTR含有一個(gè)鐵反應(yīng)元件(IRE)CAGTGA，3UTR含有一個(gè)加尾信號(hào)序列ATTAAA，末端具有polyA尾巴。預(yù)測(cè)編碼的Ferrit

4、in氨基酸序列的分子量(Mw)為20.0kDa，理論等電點(diǎn)(pI)為5.00。該蛋白具有脊椎動(dòng)物鐵蛋白H亞基保守的特征結(jié)構(gòu)域，即一個(gè)鐵氧化酶中心(Tyr26，Tyr29，Tyr31)和一個(gè)鐵核形成位點(diǎn)(Glu59，His62)，推測(cè)其同時(shí)具有H亞基和L亞基特性。預(yù)測(cè)氨基酸序列并未發(fā)現(xiàn)信號(hào)肽，也未預(yù)測(cè)到可能的跨膜結(jié)構(gòu)；位于細(xì)胞質(zhì)、線粒體和細(xì)胞核中的可能性分別為73.9%、8.7%和8.7%，而在其他細(xì)胞器中的可能性更小，證明Ferriti

5、n合成后定位在細(xì)胞質(zhì)。（2）鐵蛋白基因的原核表達(dá)Ferritin基因F與表達(dá)載體pET28a連接構(gòu)建得到原核表達(dá)載體，IPTG終濃度為1mM、37℃誘導(dǎo)4h，在BL21(DE3)大腸桿菌中得到大量表達(dá)。2.銅鋅超氧化物歧化酶基因研究結(jié)果（1）銅鋅超氧化物歧化酶基因的克隆及序列分析克隆獲得的稀杯盔形珊瑚的銅鋅超氧化物歧化酶(CuZnSOD)基因cDNA全序列為730bp，5UTR為111bp，3UTR為188bp，F(xiàn)為471bp，編碼15