HSCCC分離純化蛇床子、白花前胡與厚樸等中活性成分研究.pdf

1、高速逆流色譜(High-SpeedCounter-CurrentChromatography，HSCCC)是利用螺旋管方向性與高速行星式運(yùn)動(dòng)相結(jié)合產(chǎn)生的一種獨(dú)特的流體動(dòng)力學(xué)現(xiàn)象，使樣品中的各組分在相對(duì)移動(dòng)的互不相溶的兩相(一相為固定相，另一相由恒流泵連續(xù)輸入，為流動(dòng)相)中實(shí)現(xiàn)高效的接觸、混合、分配和傳遞，并按照分配系數(shù)的不同依次沈脫而獲得分離的一種完全的液液色譜[1]。它消除了由于使用載體而帶來(lái)的樣品吸附、污染、峰形變形等現(xiàn)象，并且已漸

2、漸從最初的進(jìn)樣量為幾十毫克的分析型發(fā)展到一次最多進(jìn)樣可達(dá)幾十克粗品的較大容量的制備型，特別適合天然藥物中活性成分的制備分離[2]。鑒于這些優(yōu)點(diǎn)，HSCCC在制備標(biāo)準(zhǔn)品、研究天然藥物化學(xué)成分以及新藥開(kāi)發(fā)等領(lǐng)域得到越來(lái)越廣泛的應(yīng)用。 中國(guó)加入WTO后，天然藥物現(xiàn)代化發(fā)展顯示出更廣闊的發(fā)展前景，對(duì)天然藥物的分離技術(shù)也提出更高的要求。HSCCC可以從復(fù)雜的天然粗制品中分離提取不同特性的有效成分，為天然藥物的發(fā)展提供了有利的條件。現(xiàn)在，應(yīng)

3、用高速逆流色譜法分離提取天然藥物中黃酮、生物堿、香豆素、蒽醌類衍生物、皂甙等有效成分方面已獲得滿意結(jié)果[3]。 本文對(duì)HSCCC在中草藥活性成分的制備性分離純化方面的應(yīng)用進(jìn)行了研究，建立了HSCCC對(duì)蛇床子中香豆素、白花前胡中香豆素、厚樸中和厚樸酚與厚樸酚以及防風(fēng)中升麻苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷制備性分離純化的方法，并利用紫外光譜、核磁共振、高效液相色譜等對(duì)目標(biāo)產(chǎn)物的純度和化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析和鑒定。 1.HSCCC分離

4、純化中藥蛇床子中的香豆素建立了HSCCC一次性分離、純化中藥蛇床子中多種香豆素類成分的新方法。應(yīng)用HSCCC從200mg樣品提取物中分離純化出六種高純度化合物，其質(zhì)量和鑒定結(jié)果如下：花椒毒素(7.6mg)，異虎耳草素(7.6mg)，佛手柑內(nèi)酯(9.7mg)，歐前胡素(60.5mg)，蛇床子素(50.6mg)，未知化合物(10.2mg)。除花椒毒素的純度為95.0％以外，其它四種均在99.0％以上。 HSCCC色譜條件如下：溶劑體

5、系：石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水，固定相：石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水(5：5：5：5，V/V)的上相，流動(dòng)相：石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水(5：5：5：5，S：5：6：4，5：5：6.5：3.5，V/V)的下相梯度洗脫，洗脫梯度為：0～100min，石油醚-乙酸1乙酯-甲醇-水(5：5：5：5，V/V)的下相，100～250min，石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水(5：5：6：4，V/V)的下相，250min以后，石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水(5：

6、5：6.5：3.5,V/V)的下相。分離溫度：35℃，流速：2.0ml/min，轉(zhuǎn)速：900rpm，固定相保留率：約60％，檢測(cè)波長(zhǎng)：254nm。 分配系數(shù)和純度的測(cè)定采用HPLC。色譜條件為：SPHERIGELODSC18柱(250mm×4.6mm.I.D.，5μm)，柱溫：25℃，流動(dòng)相：甲醇：乙腈：水梯度洗脫，洗脫梯度：0～30min，甲醇-乙腈-水30：30：40→50：30：20；流速：1.0ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為2

7、54nm。 制得的各組分的結(jié)構(gòu)鑒定采用紫外光譜和核磁共振技術(shù)，紫外光譜圖和核磁數(shù)據(jù)見(jiàn)文2。2.HSCCC分離純化中藥白花前胡中的香豆素建立了HSCCC一次性分離純化中藥白花前胡中多種香豆素的新方法。應(yīng)用HSCCC從110mg中藥白花前胡提取物中分離純化出五種化合物，其質(zhì)量與鑒定結(jié)果為：前胡香豆素D(5.3mg)，Pd-Ib(7.7mg)，白花前胡丙素(35.8mg)，白花前胡乙素(31.9mg)，未知化合物(6.4mg)。除Pd

8、-Id的純度為92.8％外，其余組分的純度均在98.6％以上。 HSCCC色譜條件如下：溶劑體系：石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水；固定相：石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水(5：5：5：5，V/V)的上相；流動(dòng)相：石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水(5：5：5：5，5：5：6.5：3.5，V/V)的下相梯度洗脫，洗脫梯度為：0～150min，石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水(5：5：5：5，V/V)的下相，150～300min，石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水

9、(5：5：5：5，V/V)的下相由100％變到0，300min后，石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水(5：5：6.5：3.5，V/V)下相；分離溫度：35℃；流速：2.0ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：254nm；轉(zhuǎn)速：900rpm；固定相保留率：55％。 分配系數(shù)及純度的測(cè)定采用HPLC。色譜條件：SPHERIGELODSC18柱(250mm×4.6mm.I.D.，5μm)；柱溫：25℃；流動(dòng)相：甲醇-水梯度洗脫，洗脫梯度為：0～30min，

10、甲醇-水75：25→80：20，30～40min，80：20→90：10，流速：0.5ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：254nm。 制得的各組分的結(jié)構(gòu)鑒定采用紫外光譜和核磁共振技術(shù)，紫外光譜圖和核磁數(shù)據(jù)見(jiàn)文3。3.HSCCC分離純化中藥厚樸中的和厚樸酚與厚樸酚2建立了HSCCC一次性分離純化中藥厚樸中有效成分和厚樸酚與厚樸酚的新方法。和厚樸酚與厚樸酚是一對(duì)同分異構(gòu)體，常規(guī)的純化制備方法煩瑣費(fèi)時(shí)，應(yīng)用HSCCC一次使可同時(shí)制備一定量的和厚

11、樸酚與厚樸酚。應(yīng)用HSCCC從100mg提取物中一次性得到33.3mg和厚樸酚和19.5mg厚樸酚，其純度分別為99.6％和99.9％。 HSCCC條件如下：溶劑體系：石油醚—乙酸乙酯—甲醇—1％乙酸(5：5：7：3，V/V)，固定相：其上相，流動(dòng)相：其下相，流速：2.0ml/min，分離溫度：20℃，轉(zhuǎn)速：900rpm，固定相保留率：60％，檢測(cè)波長(zhǎng)：254nm。分配系數(shù)及純度測(cè)定采用HPLC。色譜條件如下：色譜柱：SPHER

12、IGELODSC18(250mm×4.6mm.ID.5μm)；流動(dòng)相：甲醇-1％乙酸梯度洗脫(0～20min，甲醇：1％乙酸：30：70→75：25)；流速：1.0ml/min；溫度：25℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：254nm。 制備得到的各組分鑒定采用紫外光譜和核磁共振技術(shù)。紫外光譜圖和核磁數(shù)據(jù)見(jiàn)文4。4.HSCCC分離純化中藥防風(fēng)中的升麻苷和5-0-甲基維斯阿米醇苷建立了HSCCC一次性分離純化中藥防風(fēng)中活性成分升麻苷和5-O-甲基維斯阿

13、米醇苷的新方法。應(yīng)用HSCCC從150mg防風(fēng)正丁醇萃取物一次性分離制得44.7mg升麻苷和21.7mg的5-0-甲基維斯阿米醇苷，其純度都在99.0％以上。 HSCCC的色譜條件如下：溶劑體系：氯仿-甲醇-水(7：6：3，V/V)，固定相：其上相，流動(dòng)相：其下相，流速：2.0ml/min，分離溫度：20℃，檢測(cè)波長(zhǎng)：254nm，轉(zhuǎn)速：900rpm，固定相保留率：55％。 分配系數(shù)及純度測(cè)定采用HPLC。色譜條件如下：色