p53誘導(dǎo)基因PIG3調(diào)控DNA-PKcs參與DNA放射損傷反應(yīng)及機(jī)制研究.pdf

1、p53誘導(dǎo)基因3(p53-inducible gene 3,PIG3),是p53蛋白在細(xì)胞凋亡初始時所誘導(dǎo)表達(dá)的基因之一。PIG3與植物氧化還原酶TED2以及哺乳動物醌氧化還原酶γ-Crystallin具有一定的同源性,其本身也具有一定的醌氧化還原酶活性,能夠參與到細(xì)胞內(nèi)活性氧的生成,抑制PIG3可使細(xì)胞內(nèi)活性氧生成減少,細(xì)胞凋亡水平降低。PIG3還介導(dǎo)了GPx3誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡。因此,PIG3被視為細(xì)胞前凋亡的標(biāo)志分子之一。近年來的研究

2、發(fā)現(xiàn)PIG3受到輻射誘導(dǎo)表達(dá),在UV與輻射模擬藥物(neocarzinostatin,NCS)引起的DNA損傷反應(yīng)中發(fā)揮了重要作用,但其具體機(jī)制尚不明確。
　　DNA依賴蛋白激酶催化亞基(DNA-dependent kinase catalytic subunit,DNA-PKcs)屬于磷脂酰激醇3相關(guān)蛋白激酶(Phosphatidylinositol-3-kinase-like kinase,PIKK)超家族。該家族成員還包括A

3、TM與ATR。DNA-PKcs的絲氨酸-蘇氨酸激酶活性可磷酸化包括自身在內(nèi)的多種底物,這些底物或作為信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子或者效應(yīng)子在DNA雙鏈斷裂的非同源末端連接修復(fù)途徑、V(D)J重組和端粒末端穩(wěn)定性中發(fā)揮重要功能。DNA-PKcs與ATM、ATR磷酸化相同的底物模序,近年來也被發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞周期檢測點等其他DNA損傷反應(yīng)途徑中發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)控作用。
　　本研究在發(fā)現(xiàn)電離輻射對PIG3基因表達(dá)的調(diào)控作用的基礎(chǔ)上,利用小干擾RNA(small in

4、terference RNA,siRNA)以及慢病毒介導(dǎo)的小發(fā)夾RNA(small hairpin RNA)瞬時敲低PIG3或構(gòu)建PIG3抑制表達(dá)細(xì)胞模型,電離輻射誘發(fā)DNA損傷,觀察PIG3敲低后細(xì)胞表型和DNA損傷反應(yīng)的變化,發(fā)現(xiàn)DNA-PKcs是其參與DNA損傷反應(yīng)的下游的調(diào)節(jié)分子,獲得了以下主要進(jìn)展:
　　1)以電離輻射誘導(dǎo)DNA損傷,可引起PIG3表達(dá)增加,6、8Gy照射肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549可明顯誘導(dǎo)PIG3蛋白水平升高,

5、而在淋巴母細(xì)胞瘤細(xì)胞系A(chǔ)HH1中,PIG3的表達(dá)隨照射劑量增加而升高,具有良好的劑量相關(guān)性。表明PIG3可能在DNA損傷反應(yīng)中發(fā)揮一定的功能。
　　2)構(gòu)建了PIG3穩(wěn)定敲低及穩(wěn)定過表達(dá)的細(xì)胞系,脈沖場凝膠電泳實驗發(fā)現(xiàn)PIG3敲低后細(xì)胞修復(fù)DNA雙鏈斷裂損傷的能力下降;輻射所引起的γ-H2AX Ser139、周期檢測蛋白Chk1 Ser317、Chk2 Thr68和Kap1 Ser824等多個DNA損傷反應(yīng)蛋白的磷酸化水平降低或持

6、續(xù)時間減短;輻射后細(xì)胞G2/M期阻滯時間延長。這些結(jié)果表明PIG3對DNA損傷反應(yīng)以及后續(xù)損傷修復(fù)過程具有重要作用。
　　3)胸腺嘧啶核苷(Thirdmine,TdR)雙阻斷法同步化細(xì)胞于G1/S期交界處后釋放,檢測細(xì)胞周期進(jìn)程,PIG3敲低細(xì)胞G2/M期時相相對延長;生長曲線的結(jié)果表明PIG3敲低后細(xì)胞生長速度減慢;對同步化后的細(xì)胞進(jìn)行western blot檢測發(fā)現(xiàn)p53蛋白在PIG3敲低細(xì)胞中隨釋放時間而誘導(dǎo),在釋放12小時

7、后達(dá)到峰值,而與對照細(xì)胞相比,cyclinB1蛋白基礎(chǔ)水平較高,但當(dāng)釋放8-12小時后細(xì)胞進(jìn)入G2/M期后其水平與對照細(xì)胞相當(dāng),表明敲低PIG3導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)cyclinB的基礎(chǔ)水平上升,細(xì)胞受照射后由于p53被高水平的誘導(dǎo)表達(dá),由此抑制cyclinB1活性及表達(dá),使細(xì)胞發(fā)生G2期阻滯進(jìn)而引起細(xì)胞周期延長,細(xì)胞倍增時間延長;與此相一致,PIG3敲低還能夠增加細(xì)胞對導(dǎo)致微管損傷的化療藥物紫杉醇的敏感性。
　　4)本研究首次發(fā)現(xiàn)PIG3能

8、夠調(diào)控DNA-PKcs水平,在PIG3敲低細(xì)胞系中DNA-PKcs蛋白水平降低,同時引起ATM水平下降;同時PIG3對DNA-PKcs的啟動子活性以及mRNA含量沒有明顯影響;在ATM缺陷細(xì)胞中敲低PIG3同樣可以引起DNA-PKcs水平的下降,表明PIG3對DNA-PKcs的調(diào)控不依賴于ATM。
　　5)本研究還發(fā)現(xiàn)PIG3敲低細(xì)胞在持續(xù)數(shù)代培養(yǎng)后,產(chǎn)生了一種對DNA-PKcs蛋白水平降低的反饋調(diào)節(jié)作用,表現(xiàn)為DNA-PKcs

9、mRNA水平明顯升高并伴隨著蛋白水平的恢復(fù)甚至升高。與之相伴隨的,PIG3敲低細(xì)胞系的DNA損傷反應(yīng)缺陷得到挽救;siRNA及慢病毒shRNA敲低PIG3不同時間后發(fā)現(xiàn)DNA-PKcs蛋白在PIG3敲低后10-12天降低隨后恢復(fù),不同細(xì)胞DNA-PKcs降低及恢復(fù)時間存在差異。而穩(wěn)定過表達(dá)PIG3的細(xì)胞系中DNA-PKcs的蛋白與mRNA水平?jīng)]有明顯變化。
　　6)本研究對PIG3敲低后細(xì)胞基礎(chǔ)水平cyclinB1升高的具體機(jī)制進(jìn)

10、行了進(jìn)一步探索。我們發(fā)現(xiàn)DNA-PKcs水平的降低或活性抑制可引起cyclinB1蛋白水平升高;這種升高作用可被蛋白酶體抑制劑MG-132所消除,表明DNA-PKcs水平降低影響了cyclinB1蛋白穩(wěn)定性;利用放線菌酮抑制蛋白合成,我們發(fā)現(xiàn)敲低DNA-PKcs或抑制其激酶活性使cyclinB1降解速度下降;以nocodazole阻斷細(xì)胞于M期,發(fā)現(xiàn)DNA-PKcs降低或活性抑制使細(xì)胞M期退出減慢;DNA-PKcs還影響了cyclinB

11、1泛素化水平,這種作用可能是通過調(diào)節(jié)APC/C復(fù)合物組分APC3和cdh1的水平來實現(xiàn)的。同時我們還發(fā)現(xiàn)DNA-PKcs能夠與APC/C復(fù)合物的催化亞基之一APC2存在相互作用,提示DNA-PKcs也可能為CyclinB1與APC/C復(fù)合物的結(jié)合提供平臺。
　　本研究的創(chuàng)新點有:
　　1、揭示了PIG3參與DNA放射損傷反應(yīng)的關(guān)鍵機(jī)制。發(fā)現(xiàn)敲低PIG3引起DNA-PKcs的暫時性下調(diào),并導(dǎo)致ATM水平下降及DNA損傷反應(yīng)與細(xì)

12、胞周期進(jìn)程異常。
　　2、揭示了細(xì)胞對DNA-PKcs下調(diào)的代償性調(diào)控。數(shù)代培養(yǎng)之后,PIG3敲低細(xì)胞產(chǎn)生了代償性反饋,表現(xiàn)為DNA-PKcsmRNA水平上升同時DNA-PKcs、ATM蛋白水平回復(fù),DNA損傷反應(yīng)缺陷被糾正。
　　3、發(fā)現(xiàn)PIG3參與細(xì)胞周期的調(diào)控。PIG3敲低后導(dǎo)致了細(xì)胞內(nèi)cyclinB1基礎(chǔ)水平的升高,細(xì)胞G2-M期延長,同時發(fā)現(xiàn)這種作用由DNA-PKcs降低所引起,并初步揭示了DNA-PKcs在cyc