AML等腫瘤頻發(fā)的IDH2突變體的結(jié)構(gòu)、功能與穩(wěn)定性研究.pdf

1、異檸檬酸脫氫酶(Isocitrate dehydrogenase，IDH)是一類在三羧酸循環(huán)中發(fā)揮關(guān)鍵作用的酶家族。人類基因組有5種IDH基因，可編碼生成三種異檸檬酸脫氫酶(IDH1、IDH2及IDH3)，其中IDH2位于線粒體，催化異檸檬酸氧化脫羧生成α-酮戊二酸(α-KG)和NADPH。已有研究表明在不同腫瘤中存在各種IDH突變體，包括急性髓細(xì)胞白血病(AML)、腦腫瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤等，其最為常見的突變堿基位于R132(IDH1)、R

2、140與R172(IDH2)。IDH突變體將α-KG轉(zhuǎn)化生成腫瘤代謝物2-羥戊二酸(2-HG)，從而紊亂了一系列α-KG依賴性雙加氧酶反應(yīng)。具體表現(xiàn)為:促進(jìn)組蛋白賴氨酸甲基化;抑制10-11易位酶家族(TET)羥甲基化，進(jìn)而激活CpG島的DNA甲基化;穩(wěn)定缺氧誘導(dǎo)因子(HIF-1α)的表達(dá)，上調(diào)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)。
　　本研究通過分析不同突變體的IDH2結(jié)構(gòu)、功能與穩(wěn)定性，將對(duì)深入理解IDH2突變導(dǎo)致腫瘤發(fā)生、增殖的分子

3、機(jī)制及其診療提供一些線索和參考。本研究選用哺乳細(xì)胞表達(dá)載體pCMV6-AC-Myc-His，通過基因克隆、重疊PCR、雙酶切鑒定與測(cè)序成功構(gòu)建11個(gè)IDH2重組表達(dá)載體:WT、R140G、R140Q、R140W、R172S、R172K、R172M、R172W、R172G、R172C、R172P。在此基礎(chǔ)上，在293T與小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞BV2中瞬時(shí)轉(zhuǎn)染過表達(dá)IDH2野生型與不同突變體，檢測(cè)蛋白表達(dá)與相關(guān)信號(hào)通路(Western)、細(xì)胞代謝（

4、檢測(cè)酶活力、葡萄糖及乳酸、ROS變化）、蛋白降解(Western)、蛋白質(zhì)與熱激蛋白90相互作用（免疫共沉淀）等實(shí)驗(yàn)，通過生物信息學(xué)同源模型構(gòu)建，分析突變對(duì)IDH2結(jié)構(gòu)的影響，并與藥物導(dǎo)致蛋白降解的結(jié)果進(jìn)行相互驗(yàn)證與比對(duì)，探究IDH2野生型和突變體之間結(jié)構(gòu)、功能與穩(wěn)定性的差異。結(jié)果表明：野生型與突變體R140/R172在293T和BV2細(xì)胞中表達(dá)水平具有明顯差異；突變體IDH2酶活力顯著低于野生型；在293T細(xì)胞中，與野生型IDH2相比

5、較，R172S、R172K、R172M、R172W、R172G、R172C、R172P突變體過表達(dá)降低細(xì)胞乳酸含量，R172S、R172K、R172W、R172G突變體過表達(dá)導(dǎo)致葡萄糖含量升高，R140G、 R140Q、 R140W、R172S、R172K、R172M、R172W、R172G、R172C突變體ROS含量均顯著降低;不同突變體的過表達(dá)對(duì)細(xì)胞PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路影響不同，其中多個(gè)突變體過表達(dá)抑制pAKT和pS6

6、的表達(dá)，并導(dǎo)致Cyclin D1表達(dá)下調(diào);這些結(jié)果表明突變體IDH2過表達(dá)減緩了細(xì)胞代謝與生長(zhǎng)。而在BV2細(xì)胞中，過表達(dá)R140Q、R140W、R172S、R172K、R172M、R172W、R172G、R172C、R172P突變體增加了TNF-α表達(dá);其中R172S、R172M、R172W、R172G突變體過表達(dá)誘導(dǎo)IL-6表達(dá)，推測(cè)這些突變體的過表達(dá)可能與炎癥反應(yīng)的發(fā)生有一定的關(guān)聯(lián)；泛素化蛋白連接酶抑制劑Bortezomib對(duì)野生型