重組百日咳鮑特氏菌腺苷酸環(huán)化酶毒素的特性分析及其檢測方法研究.pdf

1、百日咳是由百日咳鮑特氏菌(簡稱百日咳桿菌)引起的一種急性呼吸道傳染病,其中尤以嬰幼兒多見。該病原菌在侵襲宿主時能產(chǎn)生百日咳毒素、腺苷酸環(huán)化酶毒素(adenylatecyclasetoxin,ACT/CyaA)等多種毒力因子,這些生物活性分子在其致病過程中發(fā)揮著重要作用。ACT屬于細(xì)菌成孔毒素RTX(repeatintoxin)家族的成員之一,其生物活性包括C端(400-1706aa)溶血活性(hemolyticactivity)和N端(

2、1-400aa)的腺苷酸環(huán)化酶活性(adenylatecyclaseactivity)。盡管研究證實(shí)ACT蛋白參與百日咳桿菌感染宿主時的免疫調(diào)節(jié),但其在細(xì)菌感染中的作用機(jī)制還不是完全清楚;此外,現(xiàn)行歐洲藥典明確指出在百日咳疫苗生產(chǎn)中應(yīng)監(jiān)測細(xì)菌毒力因子ACT蛋白,以加強(qiáng)疫苗的質(zhì)量控制,但目前我國并沒有相關(guān)檢測ACT的方法。針對上述研究現(xiàn)狀,本課題應(yīng)用DNA重組技術(shù),原核表達(dá)并純化重組ACT蛋白,通過基因水平的突變得到不同形式的ACT蛋白,

3、并從細(xì)胞毒性和腺苷酸環(huán)化酶活性兩方面對重組ACT的活性進(jìn)行鑒定,研究分析ACT調(diào)節(jié)固有免疫應(yīng)答的功能特性,初步探討其在百日咳感染中的作用機(jī)制;同時應(yīng)用純化重組蛋白制備ACT特異性的單克隆抗體和多克隆抗體,建立檢測ACT的ELISA方法,并對方法進(jìn)行驗(yàn)證。
　　一、百日咳桿菌腺苷酸環(huán)化酶毒素的重組表達(dá)和純化
　　根據(jù)已知的ACT及其修飾蛋白CyaC的基因序列設(shè)計、合成引物,進(jìn)行PCR擴(kuò)增,并將上述兩種目的基因特異性擴(kuò)增產(chǎn)物連接

4、到同一雙表達(dá)質(zhì)粒pETduet-1中;重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)BL21(DE3),經(jīng)氨芐青霉素抗性篩選,PCR、酶切和測序鑒定為陽性的克隆,用異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropy-β-D-thiogalactoside,IPTG)誘導(dǎo)ACT和CyaC表達(dá);采用硫酸銨沉淀法和DEAE離子交換層析法對ACT蛋白進(jìn)行純化。成功構(gòu)建了ACT及其修飾蛋白CyaC的共表達(dá)體系,最終獲得了大量高純度的重組ACT蛋白。純化的重組蛋白進(jìn)行了SDS-P

5、AGE、ELISA和WesternBlot檢測分析,結(jié)果顯示重組ACT與百日咳臨床分離株全菌體免疫小鼠血清以及全細(xì)胞百日咳疫苗免疫血清均存在較強(qiáng)抗原抗體反應(yīng),同時與共純化無細(xì)胞百日咳疫苗免疫小鼠血清之間存在一定抗原抗體反應(yīng)。應(yīng)用親和層析法對重組蛋白進(jìn)行了細(xì)菌內(nèi)毒素(endotoxin)的去除處理,并通過鱟試驗(yàn)法對處理前后樣品中殘余的內(nèi)毒素進(jìn)行了測定,結(jié)果顯示成功去除了重組蛋白中絕大部分的內(nèi)毒素,每微克蛋白中內(nèi)毒素濃度僅為145.5pg。

6、
　　二、重組腺苷酸環(huán)化酶毒素蛋白特性和功能分析
　　采用噻唑藍(lán)(thiazolylblue,MTT)檢測試驗(yàn)和乳酸脫氫酶(lacticdehydrogenase,LDH)釋放測定試驗(yàn)檢測分析重組ACT作用于J774A.1鼠巨噬細(xì)胞的毒性反應(yīng),同時分析J774A.1細(xì)胞內(nèi)cAMP水平的變化和BHK21細(xì)胞形態(tài)變化,評價重組ACT的腺苷酸環(huán)化酶活性。結(jié)果顯示ACT作用于J774A.1細(xì)胞后,可引起其細(xì)胞內(nèi)cAMP濃度的上升,并

7、釋放出LDH,表明重組ACT具有較強(qiáng)的細(xì)胞毒性和腺苷酸環(huán)化酶活性,且隨著其濃度的增加,細(xì)胞毒性增強(qiáng)。而突變?nèi)笔佘账岘h(huán)化酶活性的重組ACT蛋白作用相同時間后未檢測到cAMP濃度的上升。此外,ACT蛋白作用于BHK21細(xì)胞能引起該細(xì)胞形態(tài)變化,由典型的兩極化纖維母細(xì)胞形態(tài)變?yōu)椴灰?guī)則的星形,部分細(xì)胞死亡,也間接表明了本研究制備重組蛋白具有腺苷酸環(huán)化酶活性。為了評價重組ACT的免疫調(diào)節(jié)功能,我們將重組ACT和脂多糖(lipopolysacch

8、aride,LPS)分別單獨(dú)刺激和共同刺激小鼠腹腔巨噬細(xì)胞,采用WesternBlot檢測細(xì)胞內(nèi)激酶活化水平,結(jié)果與單獨(dú)刺激組比較,共同刺激組的p-NF-κB水平明顯增加,p-p38和p-JNK輕度增加;采用ELISA法檢測細(xì)胞上清中的細(xì)胞因子,結(jié)果共同刺激的細(xì)胞分泌IL-1β、IL-6和IL-10明顯增多,TNF-α和IL-12明顯減少,與LPS單獨(dú)刺激比較,呈現(xiàn)顯著性差異(P<0.01)。此外,ACT單獨(dú)作用也能誘導(dǎo)較高水平的IL-

9、6的分泌,與共同刺激組比較,無顯著性差異(P>0.05)。
　　三、抗ACT抗體的制備及其檢測方法的建立
　　采用雜交瘤細(xì)胞術(shù)建立了四株分泌抗ACT的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株,并通過雜交瘤細(xì)胞誘生腹水大量制備了四株ACT特異性的小鼠單克隆抗體,各株腹水效價均在1:104以上。同時經(jīng)多次免疫獲得ACT特異的兔多抗血清。之后分別采用辛酸-硫酸銨沉淀法和蛋白A親和層析法純化單抗和多抗,純化后抗體純度達(dá)90％以上。對抗體進(jìn)行了濃度測

10、定,并采用SDS-PAGE、ELISA、狹縫雜交和WesternBlot方法對抗體純度、分子量、抗原特異性和效價等進(jìn)行了鑒定,結(jié)果顯示抗體與重組ACT特異性反應(yīng)。篩選了兩株識別不同位點(diǎn)(阻斷抑制率均大于75%)的兩株單抗,矩陣法確定了3F9作為包被抗體,其最佳工作濃度為5μg/ml;而辣根過氧化物酶標(biāo)記的1B8作為檢測抗體,其最佳工作濃度為1:5000倍稀釋,約為2μg/ml。建立的定量檢測ACT的ELISA方法,靈敏度為1.17μg/

11、L;平均批內(nèi)變異系數(shù)(CV)為9.93%,平均批間變異系數(shù)(CV)為10.24%;平均回收率為103.24%;且方法有良好特異性,與百日咳桿菌主要抗原百日咳毒素、百日咳粘附素、絲狀血凝素、凝集原和氣管定植因子均無交叉反應(yīng)。
　　本研究成功構(gòu)建了ACT及其修飾蛋白CyaC的共表達(dá)體系,并經(jīng)原核表達(dá)和純化獲得了大量較高純度的重組ACT蛋白,為后續(xù)開展ACT相關(guān)研究奠定了基礎(chǔ);對制備的重組ACT蛋白進(jìn)行了系統(tǒng)地活性分析,證實(shí)了重組ACT

12、具有細(xì)胞毒性和腺苷酸環(huán)化酶活性;ACT能減弱LPS誘導(dǎo)的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞分泌IL-12和TNFα等促進(jìn)免疫應(yīng)答的細(xì)胞因子能力,而增強(qiáng)其分泌抑制型細(xì)胞因子IL-10的能力,進(jìn)一步驗(yàn)證了ACT可通過Toll樣受體(Toll-LikeReceptor,TLR)介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)途徑影響固有免疫應(yīng)答。實(shí)驗(yàn)室前期研究結(jié)果顯示ACT與TLR通路中的含有TIR結(jié)構(gòu)域的接頭蛋白(TIRdomaincontainingadaptorprotein,TIRAP