簡介：分類號泰山醫(yī)學院泰山醫(yī)學院碩士學位論文碩士學位論文論文題目目SCUBE2在結直腸癌中的表達及在結直腸癌中的表達及分子生物學機制研究分子生物學機制研究作者姓名宋名宋琦學科、專科、專業(yè)病理學與病理生理學業(yè)病理學與病理生理學學位類型科學學位型型科學學位型研究方向腫瘤病理學向腫瘤病理學指導教師王學春師王學春教授教授入學時間間2012年9月論文工作起止時間論文工作起止時間2013年9月2015年4月學號2012010泰山醫(yī)學院碩士學位論文1SCUBE2在結直腸癌中的表達及分子生物學機制研究在結直腸癌中的表達及分子生物學機制研究研究生宋研究生宋琦專業(yè)病理學與病理生理學業(yè)病理學與病理生理學導師王學春師王學春教授教授中文摘要中文摘要目的目的本研究的目的是探討抑癌基因SCUBE2在結直腸癌中的表達，并進一步研究其在結直腸癌發(fā)生發(fā)展中的分子生物學機制，以期發(fā)現新的結直腸癌抑癌基因。方法方法應用實時熒光定量聚合酶鏈反應（REALTIMEPCR）檢測40例結直腸癌患者腫瘤組織及癌旁正常組織SCUBE2基因MRNA的表達水平，通過WESTERNBLOT以及免疫組織化學法分別檢測4例及120例結直腸癌患者腫瘤組織及癌旁正常組織SCUBE2的蛋白表達水平并與臨床病理學特征作相關分析。KAPLANMEIER法和COX比例風險回歸模型分析結直腸癌中的差異表達的SCUBE2與術后患者生存率及復發(fā)的關系。通過體外細胞學實驗，研究SCUBE2對結直腸癌細胞RKO增殖、凋亡、侵襲與遷移等惡性生物學行為的影響。探討SCUBE2在結直腸癌中的表達及分子生物學機制。結果結果REALTIMEPCR證實，結直腸癌組織中775（3140）的SCUBE2MRNA表達水平較癌旁正常組織下調倍數超過2倍以上，120例結直腸癌組織芯片及WESTERNBLOT證實，SCUBE2蛋白表達水平在結直腸癌組織中表達顯著低于配對正常組織，表達與結直腸癌的臨床分期、腫瘤進展（P0001）及淋巴結轉移、遠處轉移、組織學分型（P005）呈負相關。KAPLANMEIER和COX比例風險模型顯示，SCUBE2陽性表達病例的總體生存率和無病生存率均顯著高于SCUBE2陰性表達的病例（P0001），并且在37例復發(fā)病例中，SCUBE2陽性表達時復發(fā)率為2432（937），而SCUBE2陰性表達時復發(fā)率則為7568（2837）。雖然SCUBE2不是結直腸癌的獨立預后因素，但是可以用于預警結直腸癌術后腫瘤的復發(fā)并判斷預后。體外功能實驗發(fā)現，過表達SCUBE2基因后能夠明顯抑制結直腸癌RKO細胞的增殖、平板克隆形成、侵襲及遷移。

簡介：碩士學位論文士學位論文科學學位科學學位2016年3月授予單位代碼授予單位代碼10089學號或申請?zhí)枌W號或申請?zhí)?0132433中國圖書中國圖書分類分類號R75823學號或申請?zhí)枌W號或申請?zhí)?0132418中國圖書中國圖書分類分類號R7351共刺激分子共刺激分子B7H3對食管癌細胞生物學特性的影響對食管癌細胞生物學特性的影響及作用機制的研究及作用機制的研究研究生生李鵬飛李鵬飛導師師單保恩單保恩教授王玲副教授副教授專業(yè)業(yè)免疫學免疫學二級學院二級學院河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院HEBEIMEDICALUNIVERSITY目錄中文摘要1英文摘要5英文縮寫11研究論文共刺激分子B7H3對食管癌細胞生物學特性的影響及作用機制的研究引言13第一部分共刺激分子B7H3對食管癌細胞生物學特性的影響前言15材料與方法16結果31附圖33附表44討論45小結47參考文獻48第二部分沉默B7H3基因表達對食管癌細胞侵襲能力抑制作用的機制研究前言50材料與方法51結果60附圖62附表67討論72小結75結論76參考文獻77綜述共刺激分子B7H3與消化系統(tǒng)腫瘤關系的研究進展78致謝89個人簡歷90

簡介：北京協(xié)和醫(yī)學院中國醫(yī)學科學院碩士研究生學位論文碩士學位論文學校代碼10023學號2013003007蛋白酶活化受體2PAR2活化YAP的分子機制及生物學功能研究MOLECULARMECHANISMANDBIOLOGYFUNCTIONOFPROTEINASEACTIVATEDRECEPTOR2PAR2INDUCEDYAPACTIVATIONMICRORNA181B在炎性結腸癌發(fā)展過程中的表達變化EXPRESSIONOFMICRORNA一181BINCOLITISASSOCIATEDCOLONICCARCINOGENESIS所院腫瘤醫(yī)院姓名賀龍梅指導教師汪紅英教授導師小組汪紅英教授劉芝華教授宋詠梅教授學科專業(yè)細胞生物學研究方向分子腫瘤學完成日期二零一六年五月北京協(xié)和醫(yī)學院中國醫(yī)學科學院碩士研究生學位論文目錄14、敲降GAB2降低PPL、FYN及YAP蛋白水平4215、YAP介導PAR2引起的炎癥恢復43151PAR2增加YAP的表達及核積累43152PAR2促進DSS引起的損傷修復45153PAR2介導的損傷修復依賴YAP的活化46討念47小結。50第二部分51引言52材料與方法一54、實驗材料一54二、主要實驗設備54三、實驗方法55四、統(tǒng)計學方法56實驗結果一57一L、MIR181B在炎癥相關結腸癌發(fā)展過程中逐漸升高572、MIR181B與DSS引起的慢性炎癥無關一583、MIR181B靶基因的預測594、QPCR檢測預測靶基因的表達一59討倉61小結63參考文獻一64資助基金一69文獻綜述一70碩士在讀期問發(fā)表與待發(fā)表論文81致謝82獨創(chuàng)性聲明一83一2

簡介：碩士學位論文碩士學位論文碩士學位論文碩士學位論文SENP1小分子抑制劑的發(fā)現設計與生物學研究小分子抑制劑的發(fā)現設計與生物學研究陳穎毅陳穎毅指導教師指導教師吳英理吳英理研究員研究員學科專業(yè)學科專業(yè)基礎醫(yī)學基礎醫(yī)學申請學位級別申請學位級別碩士學位碩士學位學號91270090479127009047培養(yǎng)單位培養(yǎng)單位基礎醫(yī)學院基礎醫(yī)學院答辯日期答辯日期2012016年4月29日導師小組成員導師小組成員張健張健研究員研究員

簡介：碩士專業(yè)學位論文論文題目MICRNAS調控胸部腫瘤中PLK1、BMI1和DAB2基因的分子機制及生物學功能的研究研究生姓名陳騰飛指導教師姓名趙軍專業(yè)名稱心胸外科學研究方向胸部腫瘤的基礎與臨床研究論文提交日期2015年5月

簡介：蒡▲乍露犬碩士學位論文原發(fā)胃非霍奇金淋巴瘤臨床與分子生物學預后因素分析THECLINICALCHARACTERISTICSANDMOLECULARPROGNOSTICANALYSISOFPATIENTSWITHPRIMARYGASTRICNONHODGKINLYMPHOMA研究生姓名陳科婷指導教師楊建民專業(yè)名稱內科學血液病培養(yǎng)單位第二軍醫(yī)大學附屬長海醫(yī)院二。一六年五月目錄摘要1ABSTRACT4英文縮略語表8一前言9一日U舌一第一部分138例原發(fā)胃DLBCL臨床與分子生物學預后因素分析11一、材料與方法1卜二、結果13一、鄉(xiāng)口才≮_上J三、討論24第二部分50例原發(fā)胃MALT淋巴瘤患者臨床特征與預后分析29一、病例資料和方法29二、結果一29一、耋口7K一么Y。三、討論35全文總結37參考文獻38一綜述43一在讀期間發(fā)表論文一55致謝56

簡介：腸易激綜合征IRRITABLEBOWELSYNDROME，IBS是一種以腹痛或腹部不適為主，伴有大便性狀改變的功能性胃腸病，全球總患病率為5％30％，國內IBS就診率占消化內科門診病人總數的343％，臨床上以腹瀉型腸易激綜合征DIARRHEAPREDOMINANTIRRITABLEBOWELSYNDROME，DIBS較多見。DIBS屬中醫(yī)“腹瀉”、“腹痛”等范疇，脾主運化，肝主疏泄，當脾胃的運化、肝的疏泄功能和升清降濁功能、大腸的傳導功能及腎的溫煦功能失調，均可能導致DIBS的發(fā)生。本病的發(fā)病常由于飲食不節(jié)、情志失調誘發(fā)，肝郁脾虛為主要發(fā)病機制。由于DIBS發(fā)病機制的多因素性、復雜性，導致其難以治愈、癥狀長期存在或反復發(fā)作，患者頻繁就醫(yī)，嚴重影響患者生活質量和心身健康。有研究發(fā)現IBS患者，糖尿病前期發(fā)生率要明顯高于健康人群，究竟在DIBS患者中2型糖尿病的發(fā)病情況如何，DIBS合并2型糖尿病患者中醫(yī)證型、精神心理狀況及生活質量等均未見報道。MICRNAMIRNA是一類長約2123NT的內源性單鏈非編碼小RNA，可通過與靶基因完全或不完全互補，在轉錄后水平對編碼蛋白的基因表達起負調控作用。部分研究學者認為MIRNA在IBS的發(fā)生發(fā)展中異常表達，但真正確認功能的MIRNA只有一部分。目前關于DIBS合并2型糖尿病MIRNA表達譜的研究鮮有報道，差異表達的MIRNAS在DIBS合并2型糖尿病發(fā)生發(fā)展的生物學過程中究竟發(fā)揮怎樣的作用尚未完全清楚。本研究首先對DIBS患者與同期體檢者的2型糖尿病發(fā)病情況進行臨床調查，并對DIBS合并2型糖尿病患者和單純DIBS患者進行問卷調查，問卷內容包括一般人口學特征、中醫(yī)證型、精神心理狀況及生活質量量表IBSQUALITYOFLIFEMEASURE，IBSQOL其次，對DIBS合并2型糖尿病患者、單純DIBS患者、2型糖尿病患者及對照組進行血漿MIRNA表達譜進行研究，篩選DIBS合并2型糖尿病差異表達的特異MIRNA，QRTPCR驗證差異表達的MIRNAS，生物信息學分析可能的發(fā)病機制最后建立DIBS合并2型糖尿病肝郁脾虛證大鼠模型，探討MIR29B在DIBS合并2型糖尿病肝郁脾虛證模型大鼠中的作用機制及生物學功能，為該病的中西醫(yī)結合臨床診斷及治療奠定理論基礎。本研究內容共分四部分第一部分DIBS合并2型糖尿病患者中醫(yī)病證及生活質量研究目的了解我國DIBS患者糖尿病的發(fā)病情況及DIBS合并2型糖尿病患者一般人口學特征、中醫(yī)證型、精神心理狀況及生活質量。方法收集2013年5月至2015年5月?lián)P州大學臨床附屬醫(yī)院江蘇省蘇北人民醫(yī)院消化門診就診的DIBS患者388例，研究對象均符合羅馬Ⅲ診斷標準，并且排除與癥狀相關的器質性疾病對照組為上述相應的醫(yī)療單位健康體檢者220人兩組均進行血糖測定。對入組患者進行臨床問卷調查，問卷內容包括一般人口學特征、中醫(yī)證型、精神心理狀況及生活質量。結果1、DIBS組2型糖尿病發(fā)病率為464％，與同期體檢者155％相比差異顯著P＜005，且2型糖尿病發(fā)病與DIBS病程長短有關，DIBS病程越長，合并2型糖尿病風險越高2、180例DIBS合并2型糖尿病患者中，肝郁脾虛證134例，占744％，脾腎陽虛證22例，占122％，脾虛濕困證17例，占95％，脾胃濕熱證7例，占39％3、DIBS合并2型糖尿病患者存在更嚴重的消化道癥狀4、DIBS合并2型糖尿病患者存在更嚴重的焦慮及抑郁5、DIBS合并2型糖尿病患者在煩躁不安、健康憂慮、沖突行為及飲食限制四個維度方面的生活質量明顯下降。結論DIBS患者2型糖尿病的發(fā)病率明顯高于健康體檢者，提示DIBS可能是2型糖尿病的高風險因素之一DIBS合并2型糖尿病患者以肝郁脾虛證為主型，且這部分患者的胃腸道癥狀、精神心理狀態(tài)及生活質量明顯低于DIBS。第二部分DIBS合并2型糖尿病血漿MIRNA表達譜及MIR29B差異表達的研究目的研究DIBS合并2型糖尿病血漿MIRNA表達譜，篩選差異表達的MIRNAS，并對差異表達MIRNA靶基因進行生物信息學分析。方法隨機選取DIBS合并2型糖尿病、DIBS、2型糖尿病、健康對照組各3例血漿標本，采用MIRNA寡核苷酸芯片進行檢驗分析，篩選出差異表達的MIRNA采用GOGENEONTOLOGY分析及KEGGKYOTOENCYCLOPEDIAOFGENESGENOMES分析對差異表達的MIRNA靶基因進行生物進程、細胞組分、分子功能、信號通路分析根據芯片結果及文獻，篩選出代表性的差異表達MIRNA，采用定量反轉錄聚合酶鏈反應QUANTIFICATIONALREALTIMEPOLYMERASECHAINREACTION，QRTPCR技術在大樣本血漿中進一步驗證，根據驗證結果對MIRNA進行受試者工作特征RECEIVEROPERATINGACTERISTIC，ROC分析。結果1、DIBS合并2型糖尿病組差異表達的MIRNA有35個，其中上調表達的MIRNA有6個，下調表達的MIRNA有29個2、生物信息學分析結果顯示，差異表達MIRNA的靶基因與細胞核內DNA依賴的轉錄調節(jié)水平及蛋白綁定關系最為密切3、DIBS合并2型糖尿病患者血漿中MIR106B、MIR29B、MIR26A存在不同程度的表達上調，與MIRNA芯片篩選結果一致。ROC分析結果顯示MIR29BROC曲線下面積（AREAUNDERROCCURVE，AUC＞09，說明其作為DIBS合并2型糖尿病診斷標志物有較高的準確性。結論通過基因芯片篩查DIBS合并2型糖尿病患者血漿中存在35個差異表達的MIRNA，且MIR29B呈特異性高表達，研究結果有望為DIBS合并2型糖尿病的診斷提供一種新的非侵入性的分子診斷方法。生物信息學分析提示差異表達的MIRNAS的靶基因與細胞核內DNA依賴的轉錄調節(jié)水平及蛋白綁定關系最為密切。第三部分DIBS合并2型糖尿病大鼠肝郁脾虛證模型的建立與評價目的探索DIBS合并2型糖尿病肝郁脾虛證大鼠模型的建立方法。方法4周齡SPF級WISTAR大鼠適應性飼養(yǎng)一周后，隨機分為普通飲食組和高脂飲食組。高脂飲食組喂養(yǎng)4周后，小劑量35MGKG多次腹腔注射新鮮配制的鏈脲佐菌素STREPTOZOCIN，STZ溶液，隨機血糖超過111MMOLL的大鼠視為2型糖尿病模型成功制備。2型糖尿病模型成功建立后，隨機選取10只建立DIBS肝郁脾虛證模型，同時普通飲食組隨機選取10只建立DIBS肝郁脾虛證模型。造模前禁食不禁水12H，予以生大黃溶液1GML灌胃，2ML只，每日兩次。在灌服生大黃溶液1H后用寬透明膠帶束縛大鼠的肩部、前肢及胸部，限制大鼠用前肢搔抓頭面部，但不限制其活動，束縛時間為1H。造模持續(xù)4周。造模結束后，觀察各組大鼠一般情況、腹瀉情況、口肛傳輸時間、內臟敏感性檢測、曠場實驗及近端結腸病理組織學變化。結果1、一般情況DIBS合并2型糖尿病組飲水量、攝食量、尿量明顯增多，體重明顯減輕2、DIBS合并2型糖尿病組大便積分明顯變大，含水量明顯增多，稀便級明顯增加3、DIBS合并2型糖尿病組口肛傳輸時間明顯減少，內臟敏感性明顯增加，曠場實驗中總路程、平均速度及進入中央區(qū)活動的時間明顯降低4、各組大鼠結腸組織形態(tài)結構未見明顯器質性改變，除對照組外，DIBS合并2型糖尿病組、DIBS組、糖尿病組結腸組織粘膜輕度水腫，偶見上皮細胞排列不整，局部少量炎性細胞浸潤。結論高脂飲食鏈脲佐菌素慢性束縛大黃煎煮液灌胃是復制DIBS合并2型糖尿病肝郁脾虛證動物模型較為合理的造模方法基于血糖、大便特征、腸道敏感性和病理組織學改變是判定DIBS合并2型糖尿病肝郁脾虛證動物模型是否成功的重要依據。第四部分基于MIR29B調節(jié)SP1IL10對DIBS合并2型糖尿病肝郁脾虛證的分子生物學研究目的研究MIR29B是否通過靶定SP1基因降低IL10表達參與DIBS合并2型糖尿病發(fā)病機制。方法采用QRTPCR方法驗證模型組大鼠血漿中MIR29B表達情況構建MSCVPIGMIR29B質粒、PGL3SP13UTR質粒和PGL3SP13UTRMUT質粒，通過雙熒光報告基因和過表達MIR29B驗證MIR29B對其靶基因SP1的直接調控作用QRTPCR方法、WESTERNBLOT及免疫組織化學的方法檢測不同動物模型結腸組織中SP1MRNA和SPI蛋白的表達情況，ELASA方法檢測血漿中IL2、IL6、IL10、TNFΑ的表達。結果1、DIBS合并2型糖尿病模型組大鼠血漿中MIR29B表達量明顯增多，與對照組相比差異顯著P＜0052、雙熒光素酶報告實驗顯示MIR29B能夠通過作用于SP13UTR區(qū)的特定位點對其進行負調節(jié)3、DIBS合并2型糖尿病模型組結腸組織中SP1MRNA和SP1蛋白表達量明顯降低4、與其他三組相比，DIBS合并2型糖尿病組IL10表達明顯下降。結論MIR29B可能是通過靶定SP1基因降低IL10表達參與DIBS合并2型糖尿病肝郁脾虛證發(fā)病機制。綜上所述DIBS組2型糖尿病發(fā)病率明顯高于健康體檢者，且DIBS合并2型糖尿病患者以肝郁脾虛證為主型，患者伴有心理異常，生活質量明顯下降MIRNA芯片篩查發(fā)現DIBS合并2型糖尿病患者血漿中存在35個差異表達MIRNA，MIR29B呈特異性高表達，生物信息學分析提示差異MIRNAS的靶基因與細胞核內DNA依賴的轉錄調節(jié)水平及蛋白綁定關系最為密切通過高脂飲食鏈脲佐菌素慢性束縛大黃煎煮液灌胃是復制DIBS合并2型糖尿病肝郁脾虛證動物模型較為合理的造模方法SP1是MIR29B直接靶基因之一，DIBS合并2型糖尿病模型組大鼠血漿中MIR29B明顯增高，腸組織中SP1MRNA及SP1蛋白表達水平明顯下降，IL10表達水平明顯降低。本研究認為MIR29B可能是通過靶定SP1基因降低IL10表達參與DIBS合并2型糖尿病肝郁脾虛證發(fā)病機制，該結果可為DIBS合并2型糖尿病肝郁脾虛證的中西醫(yī)結合診斷和治療提供一定的理論依據。

簡介：第三軍醫(yī)大學研究生學位論文獨創(chuàng)性聲明秉承學校嚴謹的校風和科研作風，本人申明所呈交的論文是我本人在導師指導下進行的研究工作及取得的研究成果。據我所知，除了文中特別加以標注和致謝的地方外，論文中不包含其他人已經發(fā)表或撰寫過的研究成果，也不包含為獲得我?；蚱渌逃龣C構的學位或證書而使用過的材料，與我同工作的同志對本研究所做的任何貢獻均已在論文中作了明確的說明并表示謝意。申請學位論文與資料若有不實之處，本人承擔一切相關責任。論文作者簽名坐日期一201魚圣壁第三軍醫(yī)大學研究生學位論文版權使用授權書本人完全了解第三軍醫(yī)大學有關保護知識產權的規(guī)定，即研究生在攻讀學位期間論文工作的知識產權單位屬第三軍醫(yī)大學。本人保證畢業(yè)離校后，發(fā)表論文或使用論文工作成果時署名單位為第三軍醫(yī)大學。學校有權保留并向國家有關部門或機構送交論文的復印件和磁盤，允許論文被查閱和借閱。學?？梢怨紝W位論文的全部或部分內容保密內容除外，可以采用影印、縮印或其他手段保存論文。論文作者簽名321材料與方法53322結果62323討論72324小結743。3MIRNA一663聯(lián)合CXCR4抑制劑AMD3100對膠質瘤移植瘤的治療效果平價75331材料與方法75332結果79333討論80334小結80第四章MIRNA126調控膠質瘤干細胞“干性”及腫瘤血管生成的機制及治療學意義8241MIRNA一126對膠質瘤干細胞“干性”和腫瘤血管生成的影響83411材料與方法83412結果944I3討論101414小結10542MIRNA一126調控膠質瘤干細胞“干性”和腫瘤血管生成的分子機制106421材料與方法106422結果110423討論121424小結12243MIRNA126與抗血管生成藥物貝伐單抗的聯(lián)合應用的治療學意義123431材料與方法。123432結果125433討論127434小結12844膠質瘤中MIRNA一126表達水平與腫瘤微血管面積和患者預后的關系129441材料與方法129442結果132443討論133

簡介：北京協(xié)和醫(yī)學院中國醫(yī)學科I堡博圭堂垡笙莖旦IL一一檄髡???????????．譬???刪307㈣5686一???中文摘要?????????????????????．．I鄴靶”??”???”“?“????LABSTRACT??????????????????????????????一??_二I???????????一．北京協(xié)和醫(yī)學院中國醫(yī)堂壁堂墮墮圭蘭篁堡莖．旦生__一一四人胃癌于細胞亞群CD44和CD90的基因表達譜芯片驗證????????????57二、討論??????????????????????????????????．．59三、小結??????????????????????????????????????．．60第三部分EN01對胃癌干細胞亞群生物學功能的作用及其分子機制??????????6L一、實驗結果????????????????????????????????一61一EN01在人胃癌干細胞亞群干性特征的研究??????????????????6L1．EN01在人胃癌干細胞亞群CD44陽性細胞中的表達??????????????6L2，EN01對人胃癌干細胞亞群CD44陽性細胞干性基因表達的影響?????????623．EN01對人胃癌于細胞亞群CD44陽性細胞自我更新的影響???????????634，ENOI對入胃癌干細胞亞群CD44陽性細胞成瘤能力的影響???????????645．EN01對人胃癌干細胞亞群CD44陽性細胞侵襲轉移的影響???????????65二單抗21A3于預人胃癌于細胞亞群生物學功能的研究??????????????661．單抗21A3對人胃癌干細胞亞群CD44陽性細胞自我更新能力的影響???????662．單抗21A3對人胃癌干細胞亞群CD44陽性細胞侵襲轉移的影響?????????67三EN01在調節(jié)人胃癌干細胞亞群信號通路的研究????????????????681．EN01在人胃癌干細胞亞群CD44陽性細胞中調節(jié)侵襲和轉移的作用機制?????682．EN01在人胃癌干細胞亞群CD44陽性細胞中調節(jié)細胞周期的作用機制??????693．EN01在人胃癌干細胞亞群CD44陽性細胞中P13K／AKT通路的作用機制?????70四EN01表達水平與胃癌臨床病理參數及預后的關系???????????????711．人胃癌組織細胞中EN01的表達水平????????????????????一712，EN01與胃癌分期、分級、轉移和預后相關性的分析??????????????72二、討論?．．?????????????????????????????????75三、，J、結??????????????????????????????????????????????80參考文獻???????????????????????????????????．．82論文綜述???????????????????????????????????．．86致謝??????????????????????????．???????????????????????94附錄?????????????????????????????????????????????????．95個人簡歷???～???????????????????????????????．96基金資助情況?????????????????????????????????，．97獨創(chuàng)性聲明??????????????????????????????????．．98TIT

簡介：廈門大學學位論文原創(chuàng)性聲明本人呈交的學位論文是本人在導師指導下，獨立完成的研究成果。本人在論文寫作中參考其他個人或集體己經發(fā)表的研究成果，均在文中以適當方式明確標明，并符合法律規(guī)范和廈門大學研究生學術活動規(guī)范試行。另外，該學位論文為課題組的研究成果，獲得課題組經費或實驗室的資助，在實驗室完成。請在以上括號內填寫課題或課題組負責人或實驗室名稱，未有此項聲明內容的，可以不作特別聲明。聲明人簽名力才年汐羅月C口日目錄目錄目J錄I摘J要VII第一章前言111腫瘤細胞的代謝L111腫瘤細胞的代謝概述1112谷氨酰胺的代謝212細胞凋亡16121細胞凋亡的機制17122細胞凋亡的功能1913絲裂原活化蛋白激酶信號通路20131ERK信號通路2L132P38信號通路22133烈K信號通路2314立題背景和研究意義27第二章材料與方法2921常用抗體和試劑2922DNA相關實驗方法。30221常用的克隆用質粒載體30222連接酶非依賴型克隆32223哺乳動物細胞表達質粒的構建3323細胞相關實驗34231細胞培養(yǎng)34232瞬時轉染34

簡介：目的考察薯蕷皂苷DIOSCIN抗肝腦缺血再灌注損傷的生物學活性并探討可能的分子作用機制。方法1在薯蕷皂苷抗肝缺血再灌注損傷HEPATICIRINJURE研究中，采用70％WISTAR大鼠肝缺血模型。預防組大鼠隨機分假手術組、模型組和高中低劑量給藥組薯蕷皂苷，60、40和20MGKG，每組10只，每天口服給予薯蕷皂苷1次，連續(xù)給藥7天治療組大鼠隨機分假手術組、模型組和給藥組薯蕷皂苷，60MGKG，每組20只，手術前2H口服給予薯蕷皂苷1次，術后每天給藥一次。檢測血清ALT、AST水平，結合組織病理學和生存率等指標來評價薯蕷皂苷對肝缺血再灌注損傷的保護作用測定肝組織中SOD、MDA、CAT、GSHPX、GSH、NO、INOS和TNOS含量來考察薯蕷皂苷的抗氧化能力采用DAPI、TUNEL和DAB分析法考察薯蕷皂苷的抗凋亡作用采用免疫組織化學、WESTERNBLOTTING及REALTIMEPCR方法考察薯蕷皂苷對凋亡和炎癥信號通路相關蛋白和基因表達影響。2在薯蕷皂苷抗腦缺血再灌注損傷CEREBRALIRINJURE研究中，體外建立PC12細胞和原代神經元細胞的OGDR模型，薯蕷皂苷200、100和50NGML預處理12H，用MTT法、LDH、NEUN的釋放測定來評價薯蕷皂苷對OGDR損傷細胞的保護作用體內建立SD大鼠MCAO的腦缺血再灌注模型，預防組大鼠隨機分假手術組、模型組和薯蕷皂苷高中低劑量給藥組60、40和20MGKG，每組10只，每天口服給予薯蕷皂苷1次，連續(xù)給藥7天治療組大鼠隨機分假手術組、模型組和薯蕷皂苷高中低劑量給藥組60、40和20MGKG，每組10只，建立MCAO模型前2H口服給予薯蕷皂苷1次，術后每天給藥一次以預防組的神經功能缺損評分、大腦TTC染色、大腦相關指數、大腦組織LDH釋放水平、組織病理學、大腦細胞標志物NEUN、GFAP和KIR41測定和TUNEL檢測，以及治療組的神經功能缺損評分和生存率來評價薯蕷皂苷對MCAO大鼠的腦保護作用采用WESTERNBLOTTING及REALTIMEPCR方法考察薯蕷皂苷對大腦中涉及HMGB1TLR4炎癥信號通路相關的蛋白和基因表達影響并采用HMBG1、TLR4SIRNA干擾和全基因過表達實驗分別驗證薯蕷皂苷是否是通過抑制HMGB1TLR4信號通路抗腦缺血再灌注損傷。結果1在抗肝缺血再灌注損傷實驗中，預防組實驗發(fā)現，與模型組相比，薯蕷皂苷能顯著降低血清ALT和AST活性，減輕由肝缺血再灌注損傷導致的肝組織損傷治療組實驗發(fā)現，與模型組相比，薯蕷皂苷60MGKG能顯著降低不同時間點血清ALT和AST酶活性，提高大鼠生存率。同時，薯蕷皂苷可顯著降低MDA、INOS、TNOS、NO含量，升高GSH、GSHPX、SOD、CAT水平，改善氧化應激，并能夠減少TUNEL陽性細胞數，減輕肝細胞的凋亡分子機制研究表明薯蕷皂苷能夠降低MAPKS磷酸化水平，下調CYP2E1、IL1Β、IL6、TNFΑ、ICAM1、MIP1Α、MIP2、NFΚB、AP1、COX2和HMGB1等炎癥因子的基因或蛋白表達水平，降低PARP、CASPASE9、CASPASE3、BAK、P53、FAS和FASL等凋亡蛋白或基因表達水平，上調BCL2和BCLX的蛋白表達水平。2在抗腦缺血再灌注損傷的實驗中，體外實驗發(fā)現，與OGDR模型組相比，薯蕷皂苷能顯著升高PC12和原代神經元的細胞活力，減少LDH釋放，增加原代神經元的NEUN釋放體內預防實驗中，與模型組相比，薯蕷皂苷能顯著改善MCAO大鼠的大腦神經功能缺損評分、減少TTC染色陽性區(qū)域、大腦LDH釋放水平、大腦相關指數以及大腦組織的GFAP、KIR41和TUNEL陽性細胞數，增加腦組織NEUN陽性細胞數體內治療實驗中，與模型組相比，薯蕷皂苷可以改善MCAO大鼠的大腦神經功能缺損評分，提高大鼠生存率。分子機制研究表明薯蕷皂苷抗腦缺血再灌注損傷是通過抑制HMGB1的核轉移，降低HMGB1蛋白表達水平，從而抑制TLR4炎癥信號通路的相關蛋白NFΚB、AP1、MAPKS、PSTAT3和炎癥因子進一步的HMGB1、TLR4SIRNA和全基因過表達實驗結果證明薯蕷皂苷抗腦缺血再灌注損傷的作用靶點是HMGB1TLR4信號通路。結論1薯蕷皂苷是通過調節(jié)氧化應激水平、抗炎和抗凋亡等途徑來實現抗肝缺血再灌注損傷的生物學作用2薯蕷皂苷有較好的抗腦缺血再灌注損傷作用，這種作用是通過抑制HMGB1TLR4信號通路來實現的?？傊?，薯蕷皂苷在抗肝腦缺血再灌注損傷方面具有較好的生物學活性，值得深入探索和研究。

簡介：本文通過研究FOXO1對于心肌細胞氧化應激損傷的作用，從而揭示FOXO1的功能是誘導氧化應激損傷還是保護損傷的心肌細胞，還是兩個兼有。同時進一步研究心肌細胞特異性缺失FOXO1促進氧化應激導致的心肌細胞凋亡的機制和FOXO1過表達通過促進細胞自噬降低細胞凋亡的機制，本研究對于尋找抗心肌缺血再灌注損傷的藥物治療靶點，提高心肌梗死治療療效意義重大目的1通過過氧化氫培養(yǎng)心肌細胞模擬過氧化自由基對心肌細胞損傷，檢測過氧化氫對心肌細胞凋亡的影響，檢測FOXO1在蛋白、MRNA以及磷酸化水平的變化。以探討FOXO1對于心肌細胞氧化應激損傷的作用。2利用轉染技術使FOXO1沉默，用不同濃度FOXO1SPECIFICSIRNA轉染心肌細胞，檢測FOXO1MRNA的含量、細胞凋亡比例。在200UM過氧化氫培養(yǎng)后，用不同濃度FOXO1SPECIFICSIRNA轉染心肌細胞，檢測CASPASE3含量、PARP含量、CASPASE3活性、自噬囊泡的形成以及及LC3Ⅱ與LC3Ⅰ的比值，以探討FOXO1與過氧化氫培養(yǎng)下心肌細胞凋亡和自噬的相關機制。方法1細胞系處理方法培養(yǎng)人類心肌細胞系H9C2，不同濃度過氧化氫培養(yǎng)細胞來模擬細胞受到氧化自由基損傷的模型，將培養(yǎng)好的H9C2細胞放置于0UM、50UM、100UM、200UMH2O2混合氣體中培養(yǎng)24到48小時。2過氧化氫培養(yǎng)H9C2心肌細胞后檢測細胞凋亡H9C2心肌細胞用0UM和200UM過氧化氫分別培養(yǎng)24小時和48小時后，用ANNEXINⅤFITC和碘化丙啶對H9C2心肌細胞進行染色，然后用流式細胞分析儀進行細胞凋亡檢測，細胞凋亡的結果用凋亡細胞比全部細胞進行表示。3過氧化氫培養(yǎng)H9C2心肌細胞后檢測CASPASE3和PARP蛋白以及CASPASE3活性表達。0UM和200UM過氧化氫分別培養(yǎng)H9C2心肌細胞24小時和48小時，通過蛋白免疫印跡電泳法檢測CASPASE3和PARP蛋白表達，通過熒光電泳法檢測H9C2心肌細胞的CASPASE3活性的表達，4過氧化氫培養(yǎng)H9C2心肌細胞后檢測FOXO1蛋白水平和FOXO1磷酸化表達0UM、50UM、100UM、200UM過氧化氫培養(yǎng)H9C2心肌細胞后，用蛋白免疫印跡試驗檢測FOXOⅠ蛋白水平和FOXO1磷酸化表達。5過氧化氫培養(yǎng)H9C2心肌細胞后檢測FOXO1MRNA水平表達0UM、50UM、100UM、200UM過氧化氫培養(yǎng)H9C2心肌細胞后，用實時反轉錄PCR檢測FOXO1MRNA水平表達。6用FOXO1SPECIFICSIRNA轉染H9C2心肌細胞，使FOXO1沉默通過轉染方法沉默FOXO1，用濃度為25NM、50NM的FOXO1SPECIFICSIRNA轉染H9C2心肌細胞，未用FOXO1SPECIFICSIRNA只有脂質體處理的作為對照組。7FOXO1SPECIFICSIRNA轉染H9C2心肌細胞后，檢測FOXO1MRNA水平表達用25NM、50NMFOXO1SPECIFICSIRNA轉染H9C2心肌細胞后，用實時反轉錄PCR檢測FOXO1SPECIFICSIRNA轉染心肌細胞和空白對照組FOXO1MRNA水平。8FOXO1SPECIFICSIRNA轉染H9C2心肌細胞后，檢測細胞凋亡用25NM、50NMMFOXO1SPECIFICSIRNA轉染H9C2心肌細胞后，用ANNEXINⅤFITC和碘化丙啶對H9C2心肌細胞進行染色，然后用流式細胞分析儀檢測FOXO1SPECIFICSIRNA轉染心肌細胞組和空白對照組的細胞凋亡。9200UM過氧化氫培養(yǎng)FOXO1SPECIFICSIRNA轉染心肌細胞和空白對照細胞后，檢測CASPASE3活性以及CASPASE3和PARP蛋白表達。200UM過氧化氫分別培養(yǎng)25NM、50NMFOXO1SPECIFICSIRNA心肌細胞和空白對照細胞后，通過熒光電泳法檢測CASPASE3活性的表達，通過蛋白免疫印跡電泳法檢測CASPASE3和PARP蛋白表達。10過氧化氫培養(yǎng)FOXO1SPECIFICSIRNA轉染心肌細胞和空白對照細胞后，檢測細胞自噬統(tǒng)計學處理全部數據采用SPSS130軟件進行統(tǒng)計學分析，多組間不同組別間差異比較采用方差分析，有統(tǒng)計學意義后進行兩兩比較，采用LSD進行多重兩兩比較，兩組間比較采用雙尾T檢驗，顯著性水平設定為005，當P值小于005，差異具有統(tǒng)計學意義。結果1過氧化氫培養(yǎng)H9C2心肌細胞后檢測細胞凋亡隨著過氧化氫培養(yǎng)濃度的增加、培養(yǎng)時間的延長，細胞凋亡增加。23過氧化氫培養(yǎng)H9C2心肌細胞后檢測CASPASE3和PARP蛋白以及CASPASE3活性表達。隨著過氧化氫培養(yǎng)濃度的增加、培養(yǎng)時間的延長，CASPASE3和PARP蛋白以及CASPASE3活性表達增加。3過氧化氫培養(yǎng)H9C2心肌細胞后檢測FOXO1蛋白水平、FOXO1MRNA水平和FOXO1磷酸化表達用0UM、50UM、100UM、200UM過氧化氫培養(yǎng)H9C2心肌細胞，FOXO1蛋白水平、FOXO1MRNA水平組間差異無統(tǒng)計學意義。與以上規(guī)律相反，H9C2心肌細胞在用0UM、50UM、100UM、200UM濃度的過氧化氫培養(yǎng)下，隨著過氧化氫濃度的增高，FOXO1的磷酸化水平逐步升高，且差異均有統(tǒng)計學意義，磷酸化程度與過氧化氫濃度呈計量依賴性。4FOXO1SPECIFICSIRNA轉染心肌細胞組和空白對照細胞組FOXO1MRNA的表達FOXO1SPECIFICSIRNA轉染細胞組FOXO1MRNA的表達低于空白對照細胞組，差異具有統(tǒng)計學意義P＜001，隨著FOXO1SPECIFICSIRNA轉染濃度的增大，FOXO1MRNA的含量逐漸減小，組間差異有統(tǒng)計學意義P＜001。5FOXO1SPECIFICSIRNA轉染心肌細胞和空白對照細胞凋亡檢測FOXO1SPECIFICSIRNA轉染細胞組細胞凋亡高于空白對照組間，差異具有統(tǒng)計學意義P＜005，隨著FOXO1SPECIFICSIRNA轉染濃度的增大，細胞凋亡升高，組間差異有統(tǒng)計學意義P＜005。6200UM過氧化氫培養(yǎng)FOXO1SPECIFICSIRNA轉染心肌細胞和空白對照細胞后，檢測CASPASE3活性以及CASPASE3和PARP蛋白表達。200UM的過氧化氫培養(yǎng)下的FOXO1SPECIFICSIRNA轉染心肌細胞的CASPASE3活性以及CASPASE3和PARP蛋白表達均高于空白對照組P＜005。隨著FOXO1SPECIFICSIRNA轉染濃度增高而增高，CASPASE3活性以及CASPASE3和PARP蛋白表達增高，組間差異具有統(tǒng)計學意義P＜005。7過氧化氫培養(yǎng)FOXO1SPECIFICSIRNA轉染心肌細胞和空白對照細胞后，檢測細胞自噬200UM過氧化氫可以明顯誘導對照組細胞自噬囊泡的形成（綠色熒光蛋白陰性點），200UM過氧化氫培養(yǎng)下，50NMFOXO1SPECIFICSIRNA細胞組自噬囊泡低于對照組（綠色熒光蛋白陰性點），200UM過氧化氫培養(yǎng)下，50NMFOXO1SPECIFICSIRNA細胞組的GFPLC3、LC3ⅡLC3Ⅰ低于對照組P＜005。即FOXO1SPECIFICSIRNA轉染H9C2心肌細胞組降低過氧化氫誘導自噬P＜001結論1過氧化氫損傷心肌細胞造模成功，并將心肌細胞FOXO1沉默（用FOXO1SPECIFICSIRNA轉染H9C2細胞）。2隨著過氧化氫濃度的升高和培養(yǎng)時間的延長，心肌細胞凋亡、CASPASE3、PARP蛋白水平及CASPASE3活性升高，呈劑量依賴性。提示過氧化氫誘導凋亡。3過氧化氫培養(yǎng)心肌細胞，FOXO1在蛋白和MRNA的水平未發(fā)生變化，隨著過氧化氫的濃度增高，FOXO1磷酸化水平升高，提示過氧化氫誘導心肌細胞凋亡可能是通過促FOXO1磷酸化，進而抑制FOXO1對心肌細胞的修復作用。4在200UM過氧化氫培養(yǎng)后，隨著FOXO1SPECIFICSIRNA轉染濃度增高，細胞凋亡比例、CASPASE3含量、PARP含量以及CASPASE3活性增高。提示FOXO1沉默促進過氧化氫誘導的心肌細胞凋亡，進而說明FOXO1抑制過氧化氫誘導的心肌細胞凋亡。5200UM過氧化氫誘導對照組細胞自噬囊泡的形成，過氧化氫培養(yǎng)FOXO1SPECIFICSIRNAH9C2轉染心肌細胞，自噬囊泡減少、LC3ⅡLC3Ⅰ降低。提示過氧化氫誘導心肌細胞自噬，FOXO1沉默降低過氧化氫誘導的心肌細胞自噬，進而說明FOXO1增強過氧化氫誘導的心肌細胞自噬。

簡介：本研究主要目的是以國內兒童肺炎鏈球菌血清型分布狀況為基礎，以分子生物學方法為手段，建立一種簡單、實用、適合發(fā)展中國家使用的肺炎鏈球菌血清型檢測“雞尾酒”策略，即將CPSB基因測序輔以優(yōu)化的序貫MPCR及血清型6A6D特異PCR相結合，并將該策略運用于肺炎鏈球菌臨床株血清型的測定，結合耐藥性檢測，對評價本地區(qū)疫苗的覆蓋率和有效性，指導合理臨床用藥提供更好的流行病學證據。第一部分CPSB基因測序檢測肺炎鏈球菌血清序列型目的利用已建立的CPSB基因測序方法對我們臨床收集的肺炎鏈球菌株進行血清序列型檢測，同時建立涵蓋目前已知肺炎鏈球菌95個血清型CPSB基因序列型數據庫，將該方法進一步完善，提高檢測的準確性。方法下載GENBANK中收錄（截止2015年1月1日）肺炎鏈球菌所有CPSB基因全長的序列，應用GENBANK中的CLUSTALW軟件和或BLASTN軟件對下載的序列進行列對、比對分析，建立肺炎鏈球菌95個血清型CPSB基因序列型數據庫。對2009年～2013年收集的我院5歲以下住院兒童中肺炎鏈球菌性疾病不同樣本來源不重復肺炎鏈球菌菌株193株，用特異性引物CPS1CPS2進行單步PCR擴增CPSB基因目的片段，繼之進行雙向測序。測序結果與GENBANK中的序列進行比對，參照我們建立的CPSB基因序列型數據庫中數據確定血清型序列型。結果我們建立的數據庫包括GENBANK中（截止2015年1月1日）所有的390個含CPSB基因全長的GENBANK收錄號，包含目前所知肺炎鏈球菌95個血清型CPSB基因732BP標準序列型的數據資料。所有193株臨床分離的肺炎鏈球菌菌株進行CPSB基因擴增均成功。基于CPSB基因在一個或多個位點的異質性，一共識別出21個序列型。其中8個序列型3，9V，6B，10B，14，19A，23F，23A是血清型特異序列型，可以由序列型直接預測出菌株的血清型5個序列型6C6D，6B6E6X，15B15C，19F19A及28F28A是同一個血清群不同血清型共享序列型，可以由序列型直接預測出菌株相應的血清群3個序列型1320，15A33B，17A34雖然也屬于多個血清型共享序列型，但無法明確菌株具體屬于哪個血清型。通過CPSB基因測序方法，193株菌中342％的菌可直接確定其血清型554％的菌可確定至相應血清群水平。結論本研究建立的肺炎鏈球菌95個血清型CPSB基因序列型數據庫對分子生物學方法檢測血清序列型是一個補充和完善。應用單步PCR進行CPSB基因測序確定肺炎鏈球菌血清序列型可以作為血清型檢測的初篩。第二部分優(yōu)化的序貫MPCR方法檢測肺炎鏈球菌血清型目的根據我國兒童肺炎鏈球菌血清型分布狀況，對美國CDC推薦的序貫MPCR方法進行優(yōu)化組合，建立一個適合我國兒童血清型檢測的序貫MPCR方法，可以在最初三個MPCR反應中識別出最常見血清型。方法采用優(yōu)化的序貫MPCR方法對收集的193株菌進行肺炎鏈球菌血清型檢測。參照美國CDC網站公布的引物序列合成肺炎鏈球菌40對血清型特異性引物和1對莢膜特異性引物。根據我國兒童肺炎鏈球菌血清型分布狀況，對美國CDC推薦的序貫MPCR前三步反應中引物進行優(yōu)化組合。優(yōu)化后的前三步MPCR反應可識別十個血清群型，包括我國兒童最常見血清群型19F，19A，14，23F及6，PCV7中包含的三個血清型4，9V9A及18C，以及近些年在血清型替換中越來越受到關注的血清型15B15C和15A15F。第一步MPCR反應包含血清群型9V9A、14、23F、15B15C的特異性引物第二步MPCR反應包含血清群型4，6和19A的特異性引物第三步MPCR反應包含血清型15A15F，18C和19F的特異性引物。每一步MPCR反應中均加入莢膜特異性引物作為內部陽性對照。如果一個標本在前三步MPCR反應中檢測均陰性，則需要按照美國CDC推薦的方法進行序貫8個MPCR反應。結果從193株臨床肺炎鏈球菌菌株中一共識別出肺炎鏈球菌12個血清群型，包括3（2株），627株，9V9A（3株），14（14株），15F15A（2株），15B15C（13株），19F（67株），19A（23株），20（2株），23F（33株），23A（2株）和34（1株）。血清型4和18C在本研究中沒有該型菌株，故擴增陰性。通過優(yōu)化的序貫MPCR前三步反應可識別大多數菌株的血清型，僅11株菌57％需要進行美國CDC推薦的序貫8步MPCR反應鑒定，其中4株菌21％改用后者依然不能進行分型。序貫MPCR方法無法分型的4株菌中2株菌CPSB基因測序顯示序列型為10B，28F28A。另有2株菌應用兩種方法均無法分型，需要進行莢膜腫脹試驗鑒定。CPSB基因測序與MPCR結果相比，兩者一致性可達922％。CPSB基因測序提示序列型是15A33B，1320A20B，17A34，序貫MPCR確定其血清型分別為15F15A，20以及34，并證實13株肺炎鏈球菌CPSB基因血清序列型為新的序列型。結論根據中國兒童血清型分布狀況，優(yōu)化的序貫MPCR反應用于肺炎鏈球菌血清分型可以彌補基因測序的不足，提高檢測準確性，并且在前三步MPCR反應中識別出常見血清型。第三部分血清型6A6D特異PCR方法檢測血清6群肺炎鏈球菌目的應用我們已建立的血清型6A6D特異PCR方法對CPSB基因測序及序貫MPCR識別出的肺炎鏈球菌血清6群菌株進一步細分其血清型。方法收集CPSB基因測序及序貫MPCR方法均鑒定為血清6群的27株肺炎鏈球菌菌株DNA。用特異性引物WCIP584ASWCIPR6B和WCIP584GSWCIPR6A，通過單步PCR擴增WCIP基因，初步將血清6群菌株區(qū)分為血清型6A6C與6B6D對血清型6A6C與6B6D菌株，用特異性引物WCINΒS1WCINΒA2再次采用單步PCR擴增WCINΒ基因，從6A6C與6B6D中分別區(qū)分血清型6C與6D菌株。結果27株CPSB測序和序貫MPCR方法均鑒定為血清6群的肺炎鏈球菌，我們采用血清型6A6D特異PCR細分血清型，發(fā)現12株血清型6A1227，444％，13株6B1327，481％，2株6C227，74％，沒有發(fā)現6D菌株。結論本研究再次證實血清型6A6D特異PCR方法能快速、簡單、有效的區(qū)分血清6群肺炎鏈球菌。第四部分CPSB基因測序輔以MPCR、血清型6A6D特異PCR檢測肺炎鏈球菌血清型的“雞尾酒”策略及臨床應用目的應用CPSB基因測序輔以優(yōu)化的序貫MPCR、血清型6A6D特異PCR的肺炎鏈球菌血清分型“雞尾酒”策略，對我院臨床收集193株肺炎鏈球菌進行血清分型，并對耐藥性進行檢測。旨在尋找一種適合于我國流行病學調查和研究的肺炎鏈球菌血清分型策略，并提供直接來自社區(qū)的肺炎鏈球菌血清型、耐藥性、疫苗覆蓋情況等資料。方法收集2009年～2013年我院5歲以下住院兒童中肺炎鏈球菌性疾病的肺炎鏈球菌193株。首先采用CPSB基因測序初篩，確定血清序列型對CPSB基因測序有歧義的結果或不能分型、新的CPSB序列型菌株應用優(yōu)化的序貫MPCR方法明確血清型對上述方法確定為血清6群的菌株應用血清型6A6D特異PCR方法細分血清型6A，6B，6C和6D。將本次研究中發(fā)現新的CPSB基因序列上傳GENBANK。采用KB法對193株菌進行抗菌素藥物敏感試驗，根據美國臨床和實驗室標準委員會CLSI2013年版標準進行判讀。結果193株肺炎鏈球菌中共識別出16個血清型。初篩后，595％菌株序列型的結果需要進一步采用優(yōu)化的序貫MPCR方法給予明確。大多數菌株血清型在序貫MPCR的前3個反應中可以識別，僅57％的菌株需要進行8個MPCR反應。多重耐藥菌比例高達868％，最常見耐藥模式紅霉素克林霉素復方新諾明。按非腦膜炎標準未檢測出耐青霉素肺炎鏈球菌，按腦膜炎標準和口服標準對青霉素耐藥性顯著增加，分別為886％和392％。結論1對國內尚無法采用傳統(tǒng)莢膜腫脹試驗進行SP血清分型的地區(qū)，本研究建立的CPSB基因測序輔以優(yōu)化的序貫MPCR、血清型6A6D特異PCR的“雞尾酒”策略是一個值得推廣的分子生物學檢測策略2血清型19A已經成為南方沿海地區(qū)一個常見的血清型PCV13血清覆蓋率高，可為本地區(qū)兒童提供更好的免疫保護血清15群（尤其15B15C）的比例高于國內其它地區(qū)報道值得引起關注3小于5歲兒童肺炎鏈球菌多重耐藥比例高，應避免使用紅霉素、克林霉素和復方新諾明治療PDS，對非腦膜炎SP感染臨床醫(yī)生仍可選用青霉素，避免選擇壓力，保護三代頭孢菌素敏感性，腦膜炎SP感染則需參考藥敏結果選擇敏感抗生素。

簡介：上海交通大學碩士學位論文MIR150在結直腸癌中的生物學作用及分子機制研究學科專業(yè)外科學（普外科）作者姓名馮君蘭導師姓名汪昱教授研究方向結直腸腫瘤申請學位級別碩士研究生學號9117009061培養(yǎng)單位上海交通大學附屬第六人民醫(yī)院關鍵詞大腸癌、MIR150、CMYB、分子資助基金項目國家科技重大新藥創(chuàng)制專項子課題2013ZX09103003016答辯日期2015年10月21日上海交通大學學位論文原創(chuàng)性聲明本人鄭重聲明所呈交的學位論文，是本人在導師的指導下，獨立進行研究工作所取得的成果。除文中已經注明引用的內容外，本論文不包含任何其他個人或集體已經發(fā)表或撰寫過的作品成果。對本文的研究做出重要貢獻的個人和集體，均已在文中以明確方式標明。本人完全意識到本聲明的法律結果由本人承擔。學位論文作者簽名日期年月日

簡介：先天性肌病（CONGENITALMYOPATHIESCMS）是一組單基因遺傳性骨骼肌疾病，臨床多以新生兒幼年起病肌無力，伴不伴肌張力低下，病情穩(wěn)定或緩慢進展，骨骼肌活檢具有特征性病理改變。根據特征性病理表現分類1）軸空性肌病（中央軸空病多迷你軸空病，軸空結構）；2）中心核肌?。ㄖ行暮思」芗〔。?；3）桿狀體肌病（桿狀體軸空桿體帽狀體）；4）肌球蛋白儲積病（胞漿異常沉積）；5）肌纖維類型不均等癥（選擇性I型肌纖維萎縮）。先天性肌病共同病理變化為肌纖維直徑大小及類型分布異常，胞漿內存在病理性特殊結構；不同于肌營養(yǎng)不良及代謝性肌病的是少見變性、壞死及再生肌纖維，無糖原及脂肪成分蓄積。CMS遺傳方式復雜多樣，包括常染色體顯性遺傳（AUTOSOMALDOMINANTINHERITANCEAD）、常染色體隱性遺傳（AUTOSOMALRECESSIVEINHERITANCEAR）、X連鎖隱性遺傳（XLINKEDRECESSIVEINHERITANCEXR）及散發(fā)多種遺傳方式，迄今為止發(fā)現30余種致病基因。CMS具有豐富的臨床遺傳異質性。每一類先天性肌病均具遺傳異質性，如桿狀體肌病由NEB、TPM2、TPM3、ACTA1、TNNT1、CFL2、KBTBD13、KLHL40和KLHL41等基因變異致?。惠S空性肌病由RYR1、MYH7、SEPN1等基因變異致?。恢行暮思〔∮蒑TM1、BIN1、DNM2、TTN基因變異致病；肌纖維類型不均由TPM2、TPM3、RYR1、ACTA1、MYH7基因變異致病。臨床異質性表現為同一基因變異導致不同的病理現象，如RYR1變異可導致中央軸空病、迷你軸空病、中心核肌病、肌纖維類型不均；ACTA1變異可導致桿狀體肌?。ò睜铙w肌病）、肌動蛋白絲聚合病、肌纖維類型不均。CMS臨床診斷面臨的問題如下1）臨床表型相似，造成CMS診斷困難；2）相同病理特點可由不同致病基因導致；3）CMS與肌原纖維病致病基因重疊；4）某些致病基因外顯子數目巨大。復雜的臨床遺傳異質性使CMS的診斷必須基于致病基因分析；傳統(tǒng)的基于CMS骨骼肌病理活檢特定的結構改變，可提示基因測序方向，但CMS上述臨床及遺傳學特點，使用傳統(tǒng)SANGER法基因分析在診斷陽性率、鑒別診斷、分型診斷及診斷時效方面均存在局限性，桎梏了CMS的分子生物學診斷廣泛應用于臨床。目的基因捕獲二代測序（NEXTGENERATIONSEQUENCINGNGS）技術，能夠一次性對多個基因的全部外顯子捕獲、測序，堿基覆蓋度達到99％，對每一個堿基檢測平均重數（測序深度）達100重以上，快速、準確、一次性完成多個目的基因的外顯子測序，相比全外顯子及全基因組測序，其所用時間少、單堿基測序費用低及生物信息分析相對簡單，因此更多應用于臨床。同時目的基因捕獲NGS技術學特點，解決了SANGER測序在CMS分子生物學診斷中的不足，推動CMS分子生物學分型診斷及鑒別診斷。本研究從河北醫(yī)科大學第三醫(yī)院骨骼肌遺傳資源標本庫（20053201512，1471例）篩選1）中央軸空病（9例）；2）中心核肌病（7例）；進行臨床、病理分析，目的基因捕獲NGS進行致病基因篩查，生物信息學分析得出的位點經患者及其無癥狀親屬（22例）SANGER法驗證。第一部分中央軸空病臨床、病理及基因分析目的本部分基于臨床、活檢骨骼肌病理診斷，篩選9例中央軸空?。–ENTRALCEDISEASECCD）患者，采用軸空性肌病目的基因捕獲NGS技術、SANGER驗證，確定致病基因及突變類型，分析、總結中國人群CCD臨床、病理及基因變異特點，并探討目的基因捕獲NGS在CCD診斷中的應用價值。方法1臨床病例入選標準1）臨床表現嬰幼兒起病的緩慢進展的四肢近端肌、腰帶肌無力、萎縮，伴不伴骨骼肌外并發(fā)癥及面肌受累；2）CK正常或輕度升高，肌電圖呈肌源性損害或正常；3）活檢骨骼肌組織化學染色呈典型中央軸空結構，除外肌營養(yǎng)不良改變，糖原、脂類正常。2歸納整理入組患者臨床資料，包括性別、發(fā)病年齡、血CK、電生理檢查結果，2例（病例1、7）行骨盆CT（COMPUTERIZEDTOMOGRAPHYCT）檢查。3活檢骨骼肌組織化學，病理分析；4例患者（病例2、3、4、8）行電子顯微鏡超微結構分析。4軸空性肌病目的基因富集（RYR1、MYH7、SEPN1）二代測序，生物信息學分析致病基因，對發(fā)現的突變應用SANGER法對患者（9例）及部分無癥狀親屬（9例）驗證。結果19例CCD患者中，男性3例，女性6例，陽性家族史者3例，年齡232歲，全部為出生后或嬰幼兒期起病。臨床表現為輕中度的非進行性近端肌無力、肌張力低下；5例具有特殊容貌（高腭弓、倒V型嘴、細長臉等），6例患者伴骨骼肌外并發(fā)癥（關節(jié)過伸展、跟腱攣縮等、脊柱側彎先天性髖關節(jié)脫位）。血CK輕度升高1例，正常8例。EMG呈肌源性損害6例，正常3例。2例骨盆CT示髖臼發(fā)育不良及臀肌萎縮。2活檢骨骼肌組織化學染色（9例）肌纖維未見明顯變性、壞死和再生，肌纖維輕中度大小不等，可見典型中央軸空結構，呈單個或多個，位于肌纖維中央或偏側。所有病例均表現為I型肌纖維萎縮；肌纖維類型分布單一I型肌纖維5例，I型肌纖維優(yōu)勢4例。電子顯微鏡超微結構特點（4例）軸空區(qū)域肌纖維結構紊亂，線粒體缺失。3目的基因捕獲NGS分析、SANGER驗證，8例患者致病基因為RYR1，共發(fā)現5個雜合突變（新發(fā)突變2個，已報位點3個）。具體如下3例新發(fā)突變（C13732TG和C13915_13923DEL），3例C14582GA，1例C14581CT，1例C13919TG。其中2例RYR1為DENOVO突變（C13919TG和C13915_13923DEL）。1例（例6）于RYR1、MYH7、SEPN1均未發(fā)現具有臨床意義致病突變。結論1CCD符合CMS的一般臨床表現。2活檢骨骼肌病理分析，中央軸空是診斷與鑒別診斷其他類型CMS、兒童遺傳性骨骼肌疾病的重要方法。3RYR1可能為中國人CCD常見致病基因，可能存在外顯子94101的附近熱點突變區(qū)域。4NGS對于發(fā)現CCD的RYR1以外基因變異具有篩查價值。第二部分中心核肌病臨床、病理及分子生物學分析目的中心核肌?。–ENTRONUCLEARMYOPATHIESCNMS）根據遺傳方式及臨床表現分為三類XR遺傳（MTM1）、AD遺傳（DNM2、CCDC78等）及AR遺傳（BIN1、RYR1等）。不同的類型存在不同的臨床表現和不同的預后。其中女性MTM1變異攜帶者患者僅有個例報道，其發(fā)病機制可能與X染色體失活偏移（SKEWEDXCHROMOSOMEINACTIVATIONSXCI）有關。本部分篩選經臨床、活檢骨骼肌病理診斷的CNMS患者7例，使用中心核肌病目的基因捕獲NGS測序技術，篩選致病基因，并對2例MTM1女性攜帶者進行X染色體失活分析?？偨Y不同亞型CNMS臨床、下肢骨骼肌MRI特點、骨骼肌病理特點；確定一組中國人群CNMS致病基因及突變類型，總結基因變異特點。方法1臨床病例入選標準1）臨床表現符合CMS，包括嬰幼兒起病的緩慢進行性加重肌無力、萎縮，運動發(fā)育遲緩，伴不伴骨骼肌外并發(fā)癥（關節(jié)攣縮、脊柱側彎）及面肌受累（細長臉、高腭弓、眼外肌麻痹等）；2）CK正?；蜉p度升高，肌電圖正?；虺始≡葱該p害；3）活檢骨骼肌組織化學染色中心核肌纖維比例增加，除外肌營養(yǎng)不良改變，糖原、脂類正常。2歸納整理入組患者臨床資料，包括性別、發(fā)病年齡、血CK、電生理檢查結果，5例患者（病例2、3、4、6、7）行雙下肢骨骼肌核磁共振成像（MAGICRESONANCEIMAGINGMRI）檢查。3活檢骨骼肌組織化學，病理分析；2例患者（病例1、7）行電子顯微鏡超微結構分析。4中心核肌病目的基因捕獲（MTM1、DNM2、BIN1、RYR1、CCDC78、TTN、SPEG、MTMR14）NGS測序，生物信息學分析致病基因，對發(fā)現的突變應用SANGER法對患者（7例）及無癥狀親屬（12例）家系驗證。5X染色體失活（XCHROMOSOMEINACTIVATION，XCI）分析2例MTM1變異的女性患者，PCR其外周血DNA擴增雄性激素受體（ROGENRECEPTAR）基因第1外顯子CAG重復序列的多肽性分析X染色體失活。X染色體失活時，位于該重復序列附近的甲基化敏感性內切酶HPAII的酶切位點被甲基化而不能被切斷，而有活性的X染色體則相反。因此，如先用HPAII對基因組DNA酶切后再進行PCR擴增，僅有失活X染色體有產物。結果17例CNMS患者中，男性3例，女性4例，例1具陽性家族史，其余患者無陽性家族史。年齡347歲，均為生后或嬰幼兒期起病，病情緩慢進展。3例（病例4、5、6）為遠端肌無力為主要及首發(fā)癥狀，其余4例主要表現為四肢近端肌無力。5例具有特殊面容（細長面容、高腭弓），3例伴眼外肌受累（眼瞼下垂、眼外肌麻痹），4例伴骨關節(jié)異常（脊柱側凸、跟腱攣縮、手指關節(jié)畸形及過伸展）；CK正常6例，升高1例；EMG呈肌源性改變。下肢骨骼肌MRI例4、6為小腿重于大腿，例2、3、7大腿重于小腿。其中例4、6大腿前群?。ü芍虚g肌）重于后群，而小腿以后群肌受累為主（比目魚肌）；例3、7大腿后群肌受累重于前群，小腿以腓腸肌及脛骨前肌輕度受累；例3小腿肌群無明顯受累。2活檢骨骼肌組織化學染色（7例）未見明顯肌纖維變性、壞死和再生，肌纖維大小不等，脂肪結締組織輕重度增生（例2彌漫性脂肪浸潤）。中心核及核集中肌纖維顯著增加；I型肌纖維小徑化，2例為I型肌纖維優(yōu)勢，2例為單一I型肌纖維，其中MTM1CNM（例1）可見項圈纖維，DNM2CNM（例4、5、6）及RYR1CNM（例7）可見輪輻狀肌纖維RADIALSARCOPLASMICSTRS，RSS。電子顯微鏡超微結構特點（2例）可見中心核呈鏈狀排列，中心核周邊區(qū)域線粒體、內質網、高爾基復合體、糖原顆粒聚集。3目的基因捕獲NGS測序、SANGER驗證，病例1、2、3為MTM1變異（分別為C10541GA、C286DUPA、C1405CG）；病例4、5、6為DNM2變異（分別為C1106GA、C1102GA、C1105CT）；例7為RYR1變異（C12237DELC、C12536GA），其中MTM1（C1405CG）及RYR1（C12237DELC）為新發(fā)突變，病例4、5為DENOVO突變。根據基因分析結果，將7例患者分型診斷病例1、2、3為MTM1變異X連鎖隱性遺傳肌管疾?。╔LINKEDRECESSIVEMYOTUBULARMYOPATHYXLMTM），病例4、5、6為DNM2變異的常染色體顯性遺傳CNM病例7為RYR1變異常染色體隱性遺傳CNM。4病例1和2X染色體失活分析XCI80病例1XCI傾斜率為8416，病例2XCI傾斜率為8317，為SXCI。結論1CNMSCNMS表型相似，臨床不能明確分型診斷；DNM2CNM具有相對一致的臨床表型，表現為下肢遠端為重的肌無力，有待進一步增加樣本量研究。2特征性骨骼肌受累肌群，一定程度上提示CNMS亞型，指導致病基因測序方向，同時可以進一步指導骨骼肌活檢部位。3中心核肌纖維明顯增多是特征性病理改變，對CNMS與其他類型CMS及其他遺傳性骨骼肌疾病的具有診斷、鑒別診斷價值。4CNMS多個基因、點突變致病，應將CNMS視為一疾病譜系，臨床表型相似、高度遺傳異質性，建議基因分析首選NGS，一次性完成診斷與鑒別診斷。5MTM1變異的女性攜帶者能夠發(fā)病并有較嚴重的臨床表現及典型中心核病理特點，癥狀較男性患者輕，可能與SXCI有關，女性XLMTM攜帶必要時應行XCI分析。6CNMS高度致殘，正確的分子生物學診斷可使先證者及其家系獲得正確的遺傳咨詢及產前診斷，避免出生缺陷。