共刺激分子B7-H3對食管癌細(xì)胞生物學(xué)特性的影響及作用機(jī)制的研究.pdf

1、惡性腫瘤嚴(yán)重威脅人類健康，其中以食管癌、胃癌、結(jié)直腸癌、胰腺癌、肝癌等為代表的消化系統(tǒng)腫瘤對患者的威脅最大。深入了解腫瘤的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制，發(fā)現(xiàn)新的腫瘤治療靶點意義重大。腫瘤的免疫療法是繼手術(shù)、放療、化療之后腫瘤治療的新方向。B7-H3（CD276），一種免疫球蛋白，是B7共刺激分子家族的新成員。B7-H3在多種腫瘤組織中高表達(dá)，并與腫瘤的進(jìn)展密切相關(guān)，是腫瘤的潛在治療靶點。
　　本課題小組始終致力于 B7共刺激分子家族在腫瘤中表達(dá)

2、意義的研究，前期研究發(fā)現(xiàn)，共刺激分子 B7-H3在人食管癌組織中高表達(dá)，其表達(dá)與患者腫瘤浸潤深度正相關(guān)，與CD8+T細(xì)胞浸潤數(shù)量成負(fù)相關(guān)。體外敲低食管癌細(xì)胞B7-H3的表達(dá)可以抑制佛波酯（PMA）誘導(dǎo)的THP-1細(xì)胞向M2型巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化。這些研究結(jié)果提示，B7-H3可能參與了食管癌的腫瘤進(jìn)展。在本研究中，首先檢測了人食管癌細(xì)胞株 KYSE-170、Eca-109、TE-13、TE-1、Eca-9706和人正常食管上皮細(xì)胞（HEEC）中B

3、7-H3的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn) B7-H3在食管癌細(xì)胞表達(dá)明顯增高。通過基因轉(zhuǎn)染敲低B7-H3的表達(dá)研究其對食管癌細(xì)胞生物學(xué)特性的影響。通過Agilent表達(dá)譜基因芯片，篩選與B7-H3表達(dá)相關(guān)的基因，探討B(tài)7-H3參與食管癌腫瘤進(jìn)展可能的作用機(jī)制。
　　第一部分共刺激分子B7-H3對食管癌細(xì)胞生物學(xué)特性的影響
　　目的：研究敲低B7-H3的表達(dá)對食管癌細(xì)胞生物學(xué)特性的影響。
　　方法：
　　1、應(yīng)用實時熒光定量PCR

4、（Real time quantitative PCR，qRT-PCR）和Western Blot法檢測人食管癌細(xì)胞株KYSE-170、Eca-109、TE-13、TE-1、Eca-9706和人正常食管上皮細(xì)胞HEEC中B7-H3 mRNA和蛋白的表達(dá)情況。
　　2、應(yīng)用轉(zhuǎn)染HuSH29mer shRNA的方法構(gòu)建B7-H3穩(wěn)定低表達(dá)的食管癌細(xì)胞株Eca-109，并通過Real time PCR、Western Blot法、熒光顯

5、微鏡觀察和流式細(xì)胞分析技術(shù)（flow cytometry，F(xiàn)CM）檢測轉(zhuǎn)染率和對基因的沉默效率。
　　3、應(yīng)用MTS實驗和克隆形成實驗，檢測下調(diào)B7-H3表達(dá)后對Eca-109細(xì)胞增殖能力的影響。
　　4、應(yīng)用劃痕實驗和Transwell小室侵襲實驗，檢測下調(diào)B7-H3表達(dá)后對Eca-109細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響。
　　5、應(yīng)用流式細(xì)胞分析技術(shù)，檢測下調(diào)B7-H3表達(dá)后對Eca-109細(xì)胞細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡的影響。<

6、br>　　6、應(yīng)用血管生成實驗，檢測下調(diào)Eca-109細(xì)胞B7-H3表達(dá)后其對血管內(nèi)皮細(xì)胞血管生成能力的影響。
　　7、應(yīng)用裸鼠皮下移植瘤模型觀察下調(diào)B7-H3表達(dá)后對Eca-109細(xì)胞體內(nèi)增殖的影響。
　　結(jié)果：
　　1、實時熒光定量PCR分析結(jié)果顯示，不同食管癌細(xì)胞株B7-H3 mRNA表達(dá)水平 KYSE-170（1.000±0.000）、Eca-109（3.210±0.609）、TE-13（1.919±0.067

7、）、TE-1（1.399±0.136）、Eca-9706（1.447±0.319）均高于人正常食管上皮細(xì)胞HEEC（0.151±0.057），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。Western Blot與Real time PCR法分析結(jié)果相一致。因為B7-H3在Eca-109細(xì)胞中表達(dá)最高，故選用Eca-109進(jìn)行后續(xù)實驗。
　　2、成功構(gòu)建了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染B7-H3沉默質(zhì)粒shRNA p-GFP-V-RS和對照無效質(zhì)粒 p-GFP-V

8、-RS TR30007(TR37)的 Eca-109細(xì)胞，并分別命名為Eca-109 shB7-H3和Eca-109 TR37。熒光顯微鏡觀察和流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果顯示，基因轉(zhuǎn)染率可達(dá)90％以上。Real-Time PCR法分析結(jié)果顯示，與Eca-109細(xì)胞（1.000±0.000）和Eca-109 TR37細(xì)胞（1.156±0.198）相比Eca-109 shB7-H3細(xì)胞（0.197±0.042）B7-H3 mRNA表達(dá)水平顯著降低，

9、對基因表達(dá)的沉默效率可達(dá)80%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），而Eca-109細(xì)胞和Eca-109 TR37細(xì)胞B7-H3 mRNA的表達(dá)水平的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）, Western Blot與Real time PCR法分析結(jié)果相一致。故選用Eca-109 shB7-H3細(xì)胞和Eca-109 TR37細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實驗。
　　3、MTS實驗和克隆形成實驗結(jié)果顯示， Eca-109 shB7-H3細(xì)胞與Eca-109

10、 TR37細(xì)胞的體外增殖能力無明顯差異（P>0.05），流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果顯示，兩種細(xì)胞的細(xì)胞周期變化無明顯差異（P>0.05），提示敲低B7-H3的表達(dá)對食管癌細(xì)胞體外增殖能力無明顯影響。
　　4、劃痕實驗結(jié)果顯示，與對照組 Eca-109 TR37細(xì)胞相比，Eca-109 shB7-H3細(xì)胞的平面遷移能力顯著下降，劃痕12h及24h后損傷愈合明顯較慢，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），提示敲低B7-H3的表達(dá)可降低Eca-10

11、9細(xì)胞的平面運動能力。
　　5、Transwell小室侵襲實驗結(jié)果顯示，與對照組Eca-109 TR37細(xì)胞相比，Eca-109 shB7-H3細(xì)胞通過人工基底膜的數(shù)量顯著下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），提示敲低B7-H3的表達(dá)可降低Eca-109細(xì)胞的侵襲能力。
　　6、流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果顯示，與對照組 Eca-109 TR37細(xì)胞相比， Eca-109 shB7-H3細(xì)胞的凋亡率顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0

12、.05），提示敲低B7-H3的表達(dá)可促進(jìn)Eca-109細(xì)胞的凋亡。
　　7、血管生成實驗結(jié)果顯示，使用培養(yǎng)Eca-109 shB7- H3細(xì)胞48 h的上清液培養(yǎng)人血管內(nèi)皮細(xì)胞8h后，人血管內(nèi)皮細(xì)胞形成網(wǎng)狀小管的長度顯著低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），提示敲低B7-H3的表達(dá)可降低Eca-109細(xì)胞的促血管生成能力。
　　8、裸鼠荷瘤實驗表明，在荷瘤28天后，實驗組（注射Eca-109 shB7-H3細(xì)胞）與對

13、照組（注射Eca-109 TR37細(xì)胞）腫瘤的平均生長大小無明顯差異（P>0.05），提示敲低B7-H3的表達(dá)對Eca-109細(xì)胞的體內(nèi)增殖能力無影響。
　　小結(jié)：
　　1、食管癌細(xì)胞B7-H3表達(dá)水平顯著上調(diào)，提示B7-H3可能參與了食管癌的腫瘤進(jìn)展。
　　2、敲低 B7-H3表達(dá)對食管癌細(xì)胞體內(nèi)外增殖能力無明顯影響，但可抑制食管癌細(xì)胞的體外遷移、侵襲和促血管生成能力，促進(jìn)食管癌細(xì)胞的凋亡。
　　第二部分沉默B

14、7-H3基因表達(dá)對食管癌細(xì)胞侵襲能力抑制作用的機(jī)制研究
　　目的：探討敲低B7-H3表達(dá)對抑制食管癌細(xì)胞侵襲的作用機(jī)制
　　方法：
　　1、應(yīng)用Agilent Sure Print G3 Human Gene Expression chip(8×60K， Design ID：039494)對前期構(gòu)建的Eca-109 shB7-H3和Eca-109 TR37細(xì)胞進(jìn)行差異基因表達(dá)分析，篩選出與B7-H3表達(dá)相關(guān)的基因。

15、r>　　2、結(jié)合功能實驗結(jié)果，通過Real time PCR、ELISA和Western Blott技術(shù)對篩選出的侵襲相關(guān)基因進(jìn)行驗證。
　　結(jié)果：
　　1、從實驗組Eca-109 shB7-H3細(xì)胞與對照組Eca-109 TR37細(xì)胞中，篩選出差異表達(dá)基因126個，其中49個基因表達(dá)顯著上調(diào)，77個基因表達(dá)顯著下調(diào)，差異倍數(shù)>=2.0，P<0.05。
　　2、ELISA法分析結(jié)果顯示，與對照組Eca-109 TR37

16、細(xì)胞相比，Eca-109 shB7-H3細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的IL-6、VEGF分泌水平明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
　　3、Real time PCR和Western Blot法分析結(jié)果顯示，實驗組Eca-109 shB7-H3細(xì)胞與對照組 Eca-109 TR37細(xì)胞相比，磷酸化 Jak-2、磷酸化STAT-3、MMP-9、MMP-7的表達(dá)水平明顯降低，TIMP-1和EFEMP-1的表達(dá)水平明顯增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意