miR-150在結(jié)直腸癌中的生物學作用及分子機制研究.pdf

1、目的：
　　檢測miR-150在大腸癌細胞中的表達水平，探討miR-150在大腸癌中所發(fā)揮的生物學角色，以及其通過調(diào)控直接靶基因來影響大腸癌發(fā)生發(fā)展的關鍵分子機制。
　　方法：
　　(1)構(gòu)建miR-150的類似物（miR-150 mimics)、miR-150的抑制序列（miR-150 inhibitor)以及它們各自的對照序列，即：miR-150 mimics、miR-150 mimics control、miR-

2、150 inhibitor、miR-150 inhibitor control、Liposome、PBS，利用實時定量聚合酶鏈反應（real-time quantitative polymerase chain reaction，qRT-PCR)檢測不同處理組對大腸癌LoVo細胞中miR-150表達的調(diào)控作用；并進一步利用細胞體外實驗MTT、流式細胞儀、Transwell實驗分別檢測在不同處理組中miR-150的表達與大腸癌LoVo細胞

3、增殖、凋亡、侵襲與轉(zhuǎn)移的相互關系。
　　(2)利用大腸癌LoVo細胞構(gòu)建裸鼠皮下移植瘤模型，通過體內(nèi)轉(zhuǎn)染齊^ Entranster瘤內(nèi)注身寸miR-150 mimics、miR-150 mimics control、miR-150 inhibitor、miR-150 inhibitor control、體內(nèi)轉(zhuǎn)染齊^ Entranster和PBS，其中miR-150 mimics control、miR-150 inhibitor

4、control、體內(nèi)轉(zhuǎn)染劑和PBS作為對照組。觀察不同處理組注射期間瘤體大小變化情況，qRT-PCR檢測不同處理組中m iR-150的表達水平，免疫組化實驗分析石蠟包埋腫瘤組織的增殖細胞核抗原PCNA表達水平，TUNEL實驗分析不同處理組中腫瘤細胞的凋亡情況。
　　(3)利用生物信息學軟件TargetScan(http://www.targetscan.org/)和PicTar(http://pictar.bio.nyu.edu)

5、預測篩選 miR-150的下游靶基因，qRT-PCR及Western blot驗證預測結(jié)果，熒光素酶報告基因驗證miR-150與靶基因的結(jié)合位點。
　　(4)構(gòu)建針對c-Myb的干擾siRNA載體并轉(zhuǎn)染大腸癌細胞LoVo; MTT檢測干擾c-Myb表達前后細胞增殖活力的變化，流式細胞儀檢測細胞凋亡率及細胞周期的變化，Transwell實驗檢測細胞侵襲與轉(zhuǎn)移能力的變化。
　　(5)利用大腸癌LoVo細胞構(gòu)建裸鼠皮下移植瘤模型，

6、通過注射針對c-Myb的干擾siRNA載體穩(wěn)轉(zhuǎn) LoVo細胞系與對照組比較分析，qRT-PCR及Western blot檢測不同處理組中c-Myb的表達水平，觀察不同兩組瘤體大小變化情況，免疫組化實驗分析石蠟包埋腫瘤組織的增殖細胞核抗原PCNA表達水平，TUNEL實驗分析不同處理組中腫瘤細胞的凋亡情況。
　　結(jié)果：
　　(1)細胞體外實驗MTT、流式細胞儀、Transwell實驗分別檢測miR-150的表達與大腸癌細胞株Lo

7、Vo增殖、凋亡、侵襲與轉(zhuǎn)移的相互關系。結(jié)果顯示，miR-150的過表達導致大腸癌細胞LoVo增殖與生存活力減弱、細胞周期阻滯于G0/G1期、細胞凋亡增加、同時降低了 LoVo細胞的侵襲與轉(zhuǎn)移能力；miR-150的抑制表達導致大腸癌細胞LoVo增殖與生存活力增強、促使細胞周期通過G1進入S/G2期、細胞凋亡減少、同時促進了LoVo細胞的侵襲與轉(zhuǎn)移能力。
　　(2)利用大腸癌細胞株LoVo建立的裸鼠移植瘤模型中，發(fā)現(xiàn)miR-150 m

8、imics顯著抑制了腫瘤的生長。QRT-PCR檢測不同處理組中miR-150表達水平，結(jié)果顯示miR-150 mimics處理組的腫瘤組織中miR-150表達水平增加，而miR-150 inhibitor處理組的腫瘤組織中miR-150表達水平顯著下調(diào)。利用腫瘤石蠟包埋組織的免疫組化實驗分析增殖細胞核抗原PCNA，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-150 mimics處理組腫瘤中核增殖抗原PCNA的表達明顯低于對照組，而miR-150 inhibito

9、r處理組腫瘤中核增殖抗原PCNA的表達明顯高于對照組；TUNEL實驗分析腫瘤細胞的凋亡情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-150 mimics處理組腫瘤細胞的凋亡明顯增加，而miR-150 inhibitor處理組腫瘤細胞的凋亡明顯低于對照組。
　　(3)利用TargetScan和PicTar軟件預測，發(fā)現(xiàn)了miR-150潛在的關鍵靶基因為c-Myb。通過熒光素報告基因檢測的方法進行了驗證分析，構(gòu)建包含c-Myb3’UTR結(jié)合位點及其突變位點

10、的熒光素酶表達載體，并分別與miR-150 mimics及mimics control共轉(zhuǎn)染大腸癌LoVo細胞，結(jié)果顯示，miR-150 mimics顯著抑制了包含c-Myb3’UTR結(jié)合位點熒光素酶表達載體的熒光活性。同時，通過qRT-PCR、Western blot及IHC檢測c-Myb在構(gòu)建LoVo離體細胞及構(gòu)建皮下移植瘤組織中的表達情況，結(jié)果表明，與對照組相比，轉(zhuǎn)染miR-150 mimics后的LoVo細胞中c-Myb mRN

11、A及蛋白的表達均下調(diào)，而轉(zhuǎn)染miR-150 inhibitor后的LoVo細胞中c-Myb mRNA及蛋白的表達均上調(diào)。
　　(4)為了進一步分析c-Myb作為癌基因在大腸癌發(fā)生發(fā)展中的生物學角色;通過構(gòu)建針對c-Myb抑制表達的c-Myb siRNA及其對照序列，然后分別轉(zhuǎn)染大腸癌LoVo細胞，qRT-PCR及western blot證實了其對大腸癌 LoVo細胞中c-Myb表達的調(diào)控作用；細胞體外實驗MTT、流式細胞儀、Tra

12、nswell實驗結(jié)果顯示，c-Myb的抑制表達導致大腸癌細胞LoVo增殖與生存活力減弱、細胞周期阻滯于G0/G1期、細胞凋亡增加、同時降低了LoVo細胞的侵襲與轉(zhuǎn)移能力。
　　(5)利用大腸癌細胞株LoVo建立的裸鼠移植瘤模型，并在裸鼠皮下移植瘤模型中檢測c-Myb對大腸癌細胞生物學行為的影響，結(jié)果顯示c-Myb siRNA顯著抑制了腫瘤的生長。qRT-PCR及western blot檢測結(jié)果顯示c-Myb siRNA處理組的腫瘤

13、組織中c-Myb表達水平顯著下調(diào)。利用腫瘤石蠟包埋組織的免疫組化實驗分析增殖細胞核抗原PCNA，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，c-Myb siRNA處理組腫瘤中核增殖抗原PCNA的表達明顯低于對照組；TUNEL實驗分析腫瘤細胞的凋亡情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，c-Myb siRNA處理組腫瘤細胞的凋亡明顯增加。
　　結(jié)論：
　　(1)miR-150可促使大腸癌細胞LoVo增殖與生存活力減弱、細胞周期阻滯于G0/G1期、細胞凋亡增加、同時降低了LoVo細胞的