簡(jiǎn)介：研究背景骨質(zhì)疏松癥是中老年人群的常見(jiàn)病以全身骨量減少骨組織的微細(xì)結(jié)構(gòu)破壞骨強(qiáng)度降低和骨折危險(xiǎn)性增高為特征。骨質(zhì)疏松癥最大的危害是骨質(zhì)疏松性骨折其中以髖部骨折危害最大不僅髖部活動(dòng)功能損傷明顯而且死亡率高。隨著老齡化社會(huì)的到來(lái)骨質(zhì)疏松癥防治的臨床與基礎(chǔ)研究已成為醫(yī)學(xué)界研究的熱點(diǎn)。運(yùn)動(dòng)是預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松的重要因素。近年來(lái)具有無(wú)創(chuàng)、副反應(yīng)小、依從性好等特點(diǎn)的物理因子療法防治骨質(zhì)疏松癥逐漸受到重視。全身振動(dòng)運(yùn)動(dòng)是振動(dòng)療法中的一種是指借助于振動(dòng)儀器使振動(dòng)刺激通過(guò)下肢或軀干作用于全身使機(jī)體整體振動(dòng)以達(dá)到防治疾病目的的方法。對(duì)去卵巢模型動(dòng)物、低骨量人群及絕經(jīng)后女性的研究顯示低于引起組織損傷的機(jī)械振動(dòng)信號(hào)低強(qiáng)度高頻率振動(dòng)LOWMAGNITUDEHIGHFREQUENCYVIBRALLIONLMHFV具有較好的增加骨形成和抑制骨吸收作用。作為一種治療骨質(zhì)疏松癥的新方法LMHFV具有無(wú)創(chuàng)、副反應(yīng)小、高依從性的特點(diǎn)能降低骨質(zhì)疏松性骨折的發(fā)生率在骨質(zhì)疏松癥的預(yù)防和治療領(lǐng)域越來(lái)越受到重視。但是LMHFV增加骨形成、抑制骨吸收的具體機(jī)制仍不清楚。研究證明振動(dòng)應(yīng)力可以影響成骨細(xì)胞的生物學(xué)特性但振動(dòng)應(yīng)力影響成骨細(xì)胞生物學(xué)特性的具體機(jī)制尚不清楚。因此研究振動(dòng)應(yīng)力影響成骨細(xì)胞生物學(xué)特性的分子機(jī)制以其作為切入點(diǎn)進(jìn)一步闡明LMHFV預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松的機(jī)制將為全身振動(dòng)運(yùn)動(dòng)預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松提供科學(xué)依據(jù)。本研究通過(guò)自行研制的細(xì)胞振動(dòng)儀對(duì)體外培養(yǎng)的成骨前體MC3T3E1細(xì)胞施加低強(qiáng)度03G、不同高頻率0、30、45、60、90HZ振動(dòng)LMHFV結(jié)合分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)觀察LMHFV對(duì)成骨前體MC3T3E1細(xì)胞生物學(xué)特性的影響及其機(jī)制的初步研究。研究?jī)?nèi)容如下目的1研究低強(qiáng)度高頻率振動(dòng)LMHFV對(duì)成骨細(xì)胞生物學(xué)特性的影響。2研究環(huán)氧合酶2COX2在LMHFV影響成骨細(xì)胞生物學(xué)特性中的作用。3研究LMHFV誘導(dǎo)成骨細(xì)胞COX2蛋白表達(dá)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。方法Ⅰ低強(qiáng)度、高頻率振動(dòng)LMHFV影響成骨細(xì)胞生物學(xué)特性的作用1LMHFV影響成骨細(xì)胞OPGRANKL比率的作用1LMHFV對(duì)成骨細(xì)胞OPGRANKL比率的影響對(duì)MC3T3E1細(xì)胞施加頻率0、30、45、60、90HZ強(qiáng)度03G時(shí)間30MIN的振動(dòng)分別于振動(dòng)后0、05、15、3、6H收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液。用酶聯(lián)免疫吸附法ELISA檢測(cè)LMHFV加載后不同時(shí)間MC3T3E1細(xì)胞分泌可溶性O(shè)PG、RANKL的情況。通過(guò)計(jì)算OPGRANKL比率將增加OPGRANKL比率最高的振動(dòng)頻率做為本實(shí)驗(yàn)繼續(xù)研究的頻率。2LMHFV加載成骨細(xì)胞條件培養(yǎng)基CONDITIONEDMEDIUMCM對(duì)破骨細(xì)胞分化成熟的影響LMHFV30HZ加載MC3T3E1細(xì)胞后含OPGRANKL比率最高的條件培養(yǎng)基CONDITIONEDMEDIAMCM30HZ及LMHFV0HZ加載后的條件培養(yǎng)基CONDITIONEDMEDIAMCM0HZ分別與含40NGMLSRANKL、20NGMLMCSF的1640培養(yǎng)基按體積比11混合形成混合培養(yǎng)基。將破骨細(xì)胞前體RAW2647細(xì)胞隨機(jī)分為CONTROL組CM0HZ、實(shí)驗(yàn)組CM30HZ混合培養(yǎng)基分別誘導(dǎo)破骨細(xì)胞前體RAW2647細(xì)胞分化5、7天。①實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)REALTIMEQUANTITATIVEPCRQPCR分別檢測(cè)第5、7天各組抗酒石酸酸性磷酸酶TRAPMRNA的表達(dá)水平②TRAP檢測(cè)試劑盒檢測(cè)第5、7天各組TRAP活性；③TRAP染色計(jì)算第7天各組多核破骨細(xì)胞形成數(shù)目。2LMHFV影響成骨細(xì)胞分化的作用1LMHFV對(duì)成骨細(xì)胞堿性磷酸酶ALP、骨鈣素OCNMRNA表達(dá)的影響MC3T3E1細(xì)胞隨機(jī)分為CONTROL組0HZ、LMHFV組30HZCONTROL組不予振動(dòng)刺激LMHFV組給予振動(dòng)刺激03G30HZ30MINDAY分別加載4、8天后收集細(xì)胞提取細(xì)胞總RNA。實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)REALTIMEQUANTITATIVEPCRQPCR檢測(cè)ALPMRNA、OCNMRNA表達(dá)以GAPDH為內(nèi)對(duì)照分析ALPMRNA、OCNMRNA相對(duì)表達(dá)的變化。2LMHFV對(duì)成骨細(xì)胞堿性磷酸酶ALP活性、骨鈣素OCN表達(dá)的影響MC3T3E1細(xì)胞隨機(jī)分為CONTROL組0HZ、LMHFV組30HZCONTROL組不予振動(dòng)刺激LMHFV組給予振動(dòng)刺激03G30HZ30MINDAY分別加載4、8天后收集細(xì)胞提取細(xì)胞總蛋白ALP檢測(cè)試劑盒檢測(cè)ALP活性；OCNELISA試劑盒檢測(cè)OCN表達(dá)；ALP活性、OCN表達(dá)均以細(xì)胞總蛋白量標(biāo)準(zhǔn)化分析ALP活性、OCN表達(dá)相對(duì)改變的變化。3LMHFV對(duì)成骨細(xì)胞礦化結(jié)節(jié)形成的影響MC3T3E1細(xì)胞隨機(jī)分為CONTROL組0HZ、LMHFV組30HZCONTROL組不予振動(dòng)刺激LMHFV組給予振動(dòng)刺激03G30HZ30MINDAY培養(yǎng)14天后茜素紅染色觀察礦化結(jié)節(jié)形成情況。Ⅱ環(huán)氧合酶COX2在LMHFV影響成骨細(xì)胞生物學(xué)特性中的作用1LMHFV對(duì)成骨細(xì)胞COX2MRNA及蛋白表達(dá)的影響MC3T3E1細(xì)胞隨機(jī)分為CONTROL組0HZ、LMHFV組30HZCONTROL組不予振動(dòng)刺激LMHFV組給予振動(dòng)刺激03G30HZ30MIN。分別于LMHFV干預(yù)結(jié)束后0、05、15、3、6H①提取細(xì)胞總RNAQPCR法檢測(cè)COX2MRNA表達(dá)以GAPDH為內(nèi)對(duì)照分析COX2MRNA相對(duì)表達(dá)的變化；②提取細(xì)胞總蛋白WESTERNBLOT檢測(cè)COX2蛋白表達(dá)以ΒACTIN為內(nèi)對(duì)照分析COX2蛋白相對(duì)表達(dá)的變化。2LMHFV對(duì)成骨細(xì)胞表達(dá)PGE2活性的影響MC3T3E1細(xì)胞隨機(jī)分為CONTROL組0HZ、LMHFV組30HZCONTROL組不予振動(dòng)刺激LMHFV組給予振動(dòng)刺激03G30HZ30MIN。分別于LMHFV加載結(jié)束后0、05、15、3、6H收集細(xì)胞培養(yǎng)上清、提取細(xì)胞總蛋白；在COX2特異性抑制劑NS398抑制實(shí)驗(yàn)中MC3T3E1細(xì)胞先與10ΜMNS398孵育1H再施加LMHFV刺激在LMHFV干預(yù)結(jié)束后05H分別收集細(xì)胞培養(yǎng)上清、提取細(xì)胞總蛋白；ELISA法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中PGE2活性并以細(xì)胞總蛋白量標(biāo)準(zhǔn)化分析PGE2活性相對(duì)表達(dá)的變化。3COX2特異性抑制劑NS398對(duì)LMHFV增加成骨細(xì)胞OPG分泌的影響MC3T3E1細(xì)胞隨機(jī)分為CONTROL0HZVEHICLE組、CONTROL0HZNS398組、LMHFV30HZVEHICLE組、LMHFV30HZNS398組。VEHICLE為溶解NS398的等量DMSOMC3T3E1細(xì)胞先與10ΜMNS398孵育1H再施加LMHFV03G30HZ30MIN刺激在LMHFV干預(yù)結(jié)束后6H分別收集細(xì)胞培養(yǎng)上清、提取細(xì)胞總蛋白；ELISA法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中可溶性O(shè)PG活性并以細(xì)胞總蛋白量標(biāo)準(zhǔn)化分析OPG分泌的變化。4COX2特異性抑制劑NS398對(duì)LMHFV誘導(dǎo)成骨細(xì)胞分化作用的影響MC3T3E1細(xì)胞隨機(jī)分為CONTROL0HZVEHICLE組、CONTROL0HZNS398組、LMHFV30HZVEHICLE組、LMHFV30HZNS398組。干預(yù)方法為對(duì)細(xì)胞施加8天的LMHFV03G30HZ30MINDAY刺激VEHICLE為溶解NS398的等量DMSO細(xì)胞與10ΜMNS398孵育8天干預(yù)結(jié)束后分別收集細(xì)胞、提取細(xì)胞總蛋白；按前述方法分別檢測(cè)ALP活性、OCN表達(dá)并以細(xì)胞總蛋白量標(biāo)準(zhǔn)化分析ALP活性、OCN表達(dá)相對(duì)改變的變化。ⅢLMHFV誘導(dǎo)成骨細(xì)胞COX2表達(dá)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制1LMHFV誘導(dǎo)成骨細(xì)胞COX2表達(dá)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑初探分別于MC3T3E1細(xì)胞施加LMHFV03G30HZ30MIN刺激前1H加入各種信號(hào)通路抑制劑NS398、STAUROSPINE、H89、U0126、SP600125、SB203580于LMHFV加載結(jié)束后3小時(shí)提取細(xì)胞總蛋白。WESTERNBLOT檢測(cè)COX2蛋白表達(dá)以ΒACTIN為內(nèi)對(duì)照分析COX2蛋白相對(duì)表達(dá)的變化。2CAMPPKA信號(hào)通路對(duì)LMHFV誘導(dǎo)成骨細(xì)胞COX2表達(dá)的影響1LMHFV對(duì)成骨細(xì)胞PKA信號(hào)通路的影響MC3T3E1細(xì)胞隨機(jī)分為CONTROL組0HZ、LMHFV組30HZCONTROL組不予振動(dòng)刺激LMHFV組給予振動(dòng)刺激03G30HZ30MIN分別于LMHFV加載結(jié)束后0、05、15、3、6H收集細(xì)胞提取細(xì)胞總蛋白。WESTERNBLOT檢測(cè)PKA總蛋白及磷酸化蛋白含量以總蛋白為對(duì)照分析PKA磷酸化蛋白含量相對(duì)值的變化。2LMHFV對(duì)成骨細(xì)胞內(nèi)CAMP水平的影響MC3T3E1細(xì)胞隨機(jī)分為CONTROL組0HZ、LMHFV組30HZCONTROL組不予振動(dòng)刺激LMHFV組給予振動(dòng)刺激03G30HZ30MIN分別于LMHFV加載結(jié)束后0、05、15、3、6H收集細(xì)胞。CAMPELISA試劑盒檢測(cè)LMHFV對(duì)成骨細(xì)胞內(nèi)CAMP水平的影響。3LMHFV加載成骨細(xì)胞含PGE2條件培養(yǎng)基CONDITIONEDMEDIUMCMPGE2對(duì)成骨細(xì)胞內(nèi)CAMP水平的影響LMHFV加載MC3T3E1細(xì)胞結(jié)束后05H分別收集0HZ、30HZ組含PGE2的條件培養(yǎng)基CMPGE2隨機(jī)將MC3T3E1細(xì)胞分為CM0HZ組、CM30HZ組與相應(yīng)的CMPGE2分別共孵育0、05、15、3、6H后收集細(xì)胞CAMPELISA檢測(cè)試劑盒檢測(cè)CMPGE2對(duì)成骨細(xì)胞內(nèi)CAMP水平的影響。4腺苷酸環(huán)化酶激活劑FSKOLINFSK對(duì)成骨細(xì)胞內(nèi)CAMP水平的影響MC3T3E1細(xì)胞與15ΜMFSK分別共孵育0、05、15、3、6H或分別與0、5、10、15、20ΜMFSK共孵育3H后按CAMPELISA檢測(cè)試劑盒要求收集細(xì)胞檢測(cè)含F(xiàn)SK對(duì)成骨細(xì)胞內(nèi)CAMP水平的影響。5PKA抑制劑對(duì)LMHFV、FSK、CMPGE2誘導(dǎo)成骨細(xì)胞COX2蛋白表達(dá)的影響在MC3T3E1細(xì)胞接受各種干預(yù)因素前加入30ΜMH89孵育1H分別于LMHFV03G、30HZ、30MIN加載細(xì)胞后3H、15ΜMFSK刺激細(xì)胞后3H、CMPGE2孵育細(xì)胞后3H收集細(xì)胞提取總蛋白。WESTERNBLOT檢測(cè)COX2蛋白表達(dá)情況ΒACTIN為內(nèi)對(duì)照分析COX2蛋白相對(duì)表達(dá)的變化。結(jié)果Ⅰ低強(qiáng)度高頻率振動(dòng)LMHFV影響成骨細(xì)胞生物學(xué)特性的作用1LMHFV影響成骨細(xì)胞OPGRANKL比率的作用1LMHFV對(duì)成骨細(xì)胞表達(dá)OPGRANKL比率的影響LMHFV加載結(jié)束后6H與0HZ相比30HZLMHFV能明顯促進(jìn)成骨細(xì)胞分泌OPGP2LMHFV加載成骨細(xì)胞條件培養(yǎng)基CONDITIONEDMEDIUMCM對(duì)破骨細(xì)胞分化成熟的影響LMHFV加載結(jié)束后6小時(shí)與0HZ相比30HZ形成的CM含OPGRANKL比率最高。①與含CM0HZ的混合培養(yǎng)基組相比在第5天CM30HZ組TRAPMRNA及活性均較CM0HZ組低差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P0069P0160；在第7天CM30HZ組TRAPMRNA及活性均較CM0HZ組低差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P2LMHFV影響成骨細(xì)胞分化的作用1LMHFV對(duì)成骨細(xì)胞堿性磷酸酶ALP、骨鈣素OCNMRNA表達(dá)的影響LMHFV加載MC3T3E1細(xì)胞4天與0HZ組相比30HZ組增加MC3T3E1細(xì)胞ALPMRNA水平其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P0006LMHFV加載MC3T3E1細(xì)胞8天與0HZ組相比30HZ組增加MC3T3E1細(xì)胞ALPMRNA及OCNMRNA水平其差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P0003P0001。2LMHFV對(duì)成骨細(xì)胞ALP活性、OCN表達(dá)的影響LMHFV加載MC3T3E1細(xì)胞4天與0HZ組相比30HZ組增加MC3T3E1細(xì)胞ALP活性其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P0031；LMHFV加載MC3T3E1細(xì)胞8天與0HZ組相比30HZ組增加MC3T3E1細(xì)胞ALP活性及OCN表達(dá)其差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P0003P0001。3LMHFV對(duì)成骨細(xì)胞礦化結(jié)節(jié)形成的影響生長(zhǎng)至80％90％匯合的MC3T3E1細(xì)胞經(jīng)0HZ、30HZLMHFV加載14天后茜素紅染色結(jié)果顯示0HZ組、30HZ組LMHFV均可見(jiàn)橘紅色鈣化結(jié)節(jié)但30HZ組鈣化結(jié)節(jié)數(shù)目較0HZ組多顏色較0HZ組深。ⅡCOX2在LMHFV影響成骨細(xì)胞生物學(xué)特性中的作用1LMHFV對(duì)成骨細(xì)胞COX2MRNA及蛋白表達(dá)的影響1與CONTROL組相比30HZLMHFV加載成骨細(xì)胞后0、05、15、3、6H振動(dòng)組COX2MRNA表達(dá)均較CONTROL組增加ALLP2與CONTROL組相比30HZLMHFV加載成骨細(xì)胞后05、15、3、6H振動(dòng)組COX2蛋白表達(dá)均較CONTROL組增加ALLP2LMHFV對(duì)成骨細(xì)胞PGE2活性表達(dá)的影響與CONTROL組相比30HZLMHFV加載成骨細(xì)胞后0、05、15、3、6H振動(dòng)組PGE2活性表達(dá)均較CONTROL組增加ALLP3COX2特異性抑制劑對(duì)LMHFV增加成骨細(xì)胞OPG分泌的影響COX2特異性抑制劑NS398對(duì)30HZLMHFV加載成骨細(xì)胞后6HOPG的分泌具有抑制作用P0012NS398可抑制LMHFV誘導(dǎo)的OPGRANKL比率升高。4COX2特異性抑制劑對(duì)LMHFV誘導(dǎo)成骨細(xì)胞分化作用的影響對(duì)30HZLMHFV加載成骨細(xì)胞8天COX2特異性抑制劑NS398可明顯抑制LMHFV誘導(dǎo)的ALP活性、OCN表達(dá)增加P0005P0001。ⅢLMHFV誘導(dǎo)成骨細(xì)胞COX2蛋白表達(dá)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制1LMHFV誘導(dǎo)成骨細(xì)胞COX2蛋白表達(dá)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑初探COX2特異性抑制劑NS398、PKA特異性抑制劑H89、ERK12特異性抑制劑U0126、P38特異性抑制劑SB203580均可抑制LMHFV誘導(dǎo)成骨細(xì)胞COX2蛋白的表達(dá)ALLP2CAMPPKA信號(hào)通路對(duì)LMHFV誘導(dǎo)成骨細(xì)胞COX2蛋白表達(dá)的影響1LMHFV對(duì)成骨細(xì)胞PKA信號(hào)通路的影響與CONTROL組相比30HZLMHFV加載成骨細(xì)胞后0、05、15、3HLMHFV組PKA磷酸化活性均較CONTROL組高其差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義ALLP2LMHFV對(duì)成骨細(xì)胞內(nèi)CAMP水平的影響與CONTROL組相比30HZLMHFV加載成骨細(xì)胞后0、05、15H振動(dòng)組細(xì)胞內(nèi)CAMP水平均較CONTROL組增加P3LMHFV加載成骨細(xì)胞含PGE2條件培養(yǎng)基CONDITIONEDMEDIUMCMPGE2對(duì)成骨細(xì)胞內(nèi)CAMP水平的影響LMHFV加載成骨細(xì)胞后05H形成的CM含PGE2水平最高與CONTROL組相比CMPGE2孵育細(xì)胞05、15、3H后CMPGE2組細(xì)胞內(nèi)CAMP水平均較CONTROL組高ALLP4腺苷酸環(huán)化酶激活劑FSKOLINFSK對(duì)成骨細(xì)胞內(nèi)CAMP水平的影響與CONTROL組相比15ΜMFSK與成骨細(xì)胞孵育05、15、3H后FSK組細(xì)胞內(nèi)CAMP水平較對(duì)照組明顯升高P0003P5PKA抑制劑對(duì)LMHFV、FSK、CMPGE2誘導(dǎo)成骨細(xì)胞COX2蛋白表達(dá)的影響與CONTROL組相比LMHFVFSK及CMPGE2均能誘導(dǎo)成骨細(xì)胞COX2蛋白表達(dá)P結(jié)論1低強(qiáng)度03G高頻率30HZ振動(dòng)LMHFV對(duì)成骨前體MC3T3E1細(xì)胞生物學(xué)特性具有積極的影響增加MC3T3E1細(xì)胞OPG分泌提高OPGRANKL濃度比；促進(jìn)MC3T3E1細(xì)胞成骨分化。2COX2信號(hào)參與了LMHFV對(duì)成骨細(xì)胞生物學(xué)特性的影響。LMHFV誘導(dǎo)MC3T3E1細(xì)胞COX2蛋白表達(dá)可能通過(guò)PKA、ERK12及P38信號(hào)通路；PGE2的自分泌作用在LMHFV通過(guò)PGE2CAMPPKA信號(hào)通路誘導(dǎo)MC3T3E1細(xì)胞COXC2蛋白表達(dá)中起重要作用。

簡(jiǎn)介：分類號(hào)密級(jí)單位代碼學(xué)號(hào)加夕≥Z1033521017007碩士學(xué)位論文⑧中文論文題目金坐猹盛紅絲塑絲簽處鱉差丞基生塹堂掛陛互窒英文論文題目CULTUREANDBIOLOGICALCHARACTERISTIC臺(tái)B壁壘LY墨I(xiàn)墨Q￡EI墜￡QBL壘繭QE』I塾塾望壘￡IG申請(qǐng)人姓名趕掛指導(dǎo)教師鄞瞳全副教握筮室塑塾援專業(yè)名稱動(dòng)物逮佳直歪生曼繁殖所在學(xué)院動(dòng)塑型堂堂瞳浙江大學(xué)研究生學(xué)位論文獨(dú)創(chuàng)性聲明本人聲明所呈交的學(xué)位論文是本人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作及取得的研究成果。除了文中特別加以標(biāo)注和致謝的地方外，論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫過(guò)的研究成果，也不包含為獲得逝婆盤鱟或其他教育機(jī)構(gòu)的學(xué)位或證書而使用過(guò)的材料。與我一同工作的同志對(duì)本研究所做的任何貢獻(xiàn)均己在論文中作了明確的說(shuō)明并表示謝意。學(xué)位論文作者簽名者拉簽字日期知／≯年石月／汐日學(xué)位論文版權(quán)使用授權(quán)書本學(xué)位論文作者完全了解逝鎏盤鱟有權(quán)保留并向國(guó)家有關(guān)部門或機(jī)構(gòu)送交本論文的復(fù)印件和磁盤，允許論文被查閱和借閱。本人授權(quán)迸姿盤鱟可以將學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索和傳播，可以采用影印、縮印或掃描等復(fù)制手段保存、匯編學(xué)位論文。保密的學(xué)位論文在解密后適用本授權(quán)書學(xué)位論文作者簽名專鲆導(dǎo)師簽名咆，午簽字日期弘／Y年鄉(xiāng)月／沙日簽字日期矽F埠6月廠己日、們

簡(jiǎn)介：南昌大學(xué)碩士學(xué)位論文褶紋冠蚌內(nèi)寄生蚌螨種群生物學(xué)及趨光性研究姓名張麗紅申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別碩士專業(yè)水生生物學(xué)指導(dǎo)教師文春根20081219摘要光照下條件下各蚌螨間均無(wú)顯著性差異。隨著光強(qiáng)的增強(qiáng)彎弓蚌螨由正趨光性向負(fù)趨光性轉(zhuǎn)變，而且負(fù)趨光指數(shù)逐漸增強(qiáng)。敏捷蚌螨均為負(fù)趨光性且負(fù)趨光性指數(shù)逐漸增加，Y紋蚌螨的負(fù)趨光性指數(shù)在光強(qiáng)為800LUX時(shí)達(dá)最大后下降。在同一光照強(qiáng)度500LUX透過(guò)七種不同光色濾色片照射時(shí)，各蚌螨均表現(xiàn)出顯著性差異PAOS，其余除在綠光下有顯著差異PAOS夕B都是極顯著性差異EA01。彎弓蚌螨僅在綠色光照下表現(xiàn)為正趨光性，其余均為負(fù)趨光性，紅、橙、黃、靛光下負(fù)趨光指數(shù)均較高；敏捷蚌螨均表現(xiàn)為負(fù)趨光性，而且靛光下負(fù)趨光性指數(shù)較高；Y紋蚌螨只在紅光下表現(xiàn)為正趨光性，其余均為負(fù)趨光性，而且紅光條件下，趨光性指數(shù)最高。關(guān)鍵詞褶紋冠蚌；蚌螨；科一群動(dòng)態(tài)；三念位；趨光性IL

簡(jiǎn)介：分類號(hào)S8553單位代碼10364密級(jí)學(xué)號(hào)12720236安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)位論文安徽地區(qū)豬傳染性胸膜肺炎血清學(xué)調(diào)查及安徽地區(qū)豬傳染性胸膜肺炎血清學(xué)調(diào)查及APP分離與生物學(xué)特性研究分離與生物學(xué)特性研究PCPSEROLOGICALINVESTIGATIONSTUDYOFISOLATIONBIOLOGICALACTERISTICSOFAPPINANHUI研究生施雷指導(dǎo)教師孫裴副教授申請(qǐng)學(xué)位門類級(jí)別農(nóng)學(xué)碩士專業(yè)名稱預(yù)防獸醫(yī)學(xué)研究方向家畜傳染病學(xué)所在學(xué)院動(dòng)物科技學(xué)院答辯委員會(huì)主席二零一五年六月獨(dú)創(chuàng)性聲明本人聲明所呈交的論文是我個(gè)人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作及取得的研究成果。盡我所知，除了文中特別加以標(biāo)注和致謝的地方外，論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫過(guò)的研究成果，也不包含為獲得安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)或其它教育機(jī)構(gòu)的學(xué)位或證書而使用過(guò)的材料。與我一同工作的同志對(duì)本研究所做的任何貢獻(xiàn)均已在論文中作了明確的說(shuō)明并表示了謝意。研究生簽名時(shí)間年月日關(guān)于論文使用授權(quán)的說(shuō)明本人完全了解安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，即學(xué)校有權(quán)保留送交論文的復(fù)印件和磁盤，允許論文被查閱和借閱，可以采用影印、縮印或掃描等復(fù)制手段保存、匯編學(xué)位論文。同意安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)可以用不同方式在不同媒體上發(fā)表、傳播學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容。保密的學(xué)位論文在解密后應(yīng)遵守此協(xié)議保密的學(xué)位論文在解密后應(yīng)遵守此協(xié)議研究生簽名時(shí)間年月日導(dǎo)師簽名時(shí)間年月日

簡(jiǎn)介：關(guān)于學(xué)位論文原創(chuàng)性和使用授權(quán)的聲明本人所呈交的學(xué)位論文，是在導(dǎo)師指導(dǎo)下，獨(dú)立進(jìn)行科學(xué)研究所取得的成果。對(duì)在論文研究期間給予指導(dǎo)、幫助和做出重要貢獻(xiàn)的個(gè)人或集體，均在文中明確說(shuō)明。本聲明的法律責(zé)任由本人承擔(dān)。本人完全了解山東農(nóng)業(yè)大學(xué)有關(guān)保留和使用學(xué)位論文的規(guī)定，同意學(xué)校保留和按要求向國(guó)家有關(guān)部門或機(jī)構(gòu)送交論文紙質(zhì)本和電子版，允許論文被查閱和借閱。本人授權(quán)山東農(nóng)業(yè)大學(xué)可以將本學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索，可以采用影印、縮印或其他復(fù)制手段保存論文和匯編本學(xué)位論文，同時(shí)授權(quán)中國(guó)科學(xué)技術(shù)信息研究所將本學(xué)位論文收錄到中國(guó)學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù)，并向社會(huì)公眾提供信息服務(wù)。保密論文在解密后應(yīng)遵守此規(guī)定。論文作者簽名皇J歪困導(dǎo)師簽名牛鎏經(jīng)垂日期絲至里笪丑3．2．3種子性狀的調(diào)查??????????????????????????．．163．3染色體的細(xì)胞學(xué)調(diào)查?????????????????????????．1．93．3．1芒草染色體數(shù)目的鑒定???????????????????????．．193．3．2五節(jié)芒染色體數(shù)目的鑒定??。????????????????????。203．3．3南荻染色體數(shù)目的鑒定???????????????????????．J213．3．4荻染色體數(shù)目的鑒定????????????????????????．．233．3．5雙藥芒染色體數(shù)目的鑒定??????????????????????．．254{寸論???????????????????????????????????????????J．．274．1芒屬植物種質(zhì)資源的重要性??????????????????????．274．2芒屬植物生物學(xué)特征的分析??????????????????????．284．3芒屬植物細(xì)胞學(xué)研究的分析??????????????????????．295結(jié)論??????????????????????????????????????．．306創(chuàng)新之處???????????????????????????????31參考文獻(xiàn)??????????????????????????????．．32I咐錄?????????????????????????????????????????????．37致{射???????????????????????????????????????????．4L攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的論文???????????????????????42

簡(jiǎn)介：心肌組織工程為缺血性心臟疾病治療提供了新的治療策略。研究人員目前在體外已成功構(gòu)建了具有節(jié)律性收縮的再造心肌組織或工程化心肌組織ENGINEEREDCARDIACTISSUESECTS，在體內(nèi)心梗修復(fù)方面也取得顯著成效。然而，考慮到心肌組織本身的電生理特性，以往用于心肌組織構(gòu)建的支架材料難以為心肌細(xì)胞提供導(dǎo)電微環(huán)境，所構(gòu)建的ECTS仍缺乏天然心肌的收縮興奮耦聯(lián)與電傳導(dǎo)特性。近年來(lái)，導(dǎo)電納米材料在電傳導(dǎo)特性的組織構(gòu)建研究中受到研究人員的高度關(guān)注，其中石墨烯已被證實(shí)在生物醫(yī)學(xué)尤其是組織工程研究中具有良好的應(yīng)用前景。此外，ECTS的體內(nèi)示蹤對(duì)于評(píng)價(jià)其對(duì)心梗治療效果及細(xì)胞行為至關(guān)重要。在諸多標(biāo)記手段中，氧化鐵納米粒IRONOXIDENANOPARTICLESIRONS因其良好的生物相容性及易檢測(cè)等優(yōu)勢(shì)廣泛應(yīng)用于體內(nèi)細(xì)胞移植及ECTS的示蹤中。但針對(duì)IRONS對(duì)心肌細(xì)胞微結(jié)構(gòu)及細(xì)胞活性影響，尤其是三維ECTS中閏盤的形成影響尚不明確。為此，本論文重點(diǎn)闡明IRONS對(duì)心肌細(xì)胞微結(jié)構(gòu)及細(xì)胞活性的影響，尤其是三維ECTS中閏盤形成的影響規(guī)律，并以氧化石墨烯GRAPHENEOXIDEGO明膠為材料，在明確其對(duì)棕色脂肪干細(xì)胞BROWNADIPOSEDERIVEDSTEMCELLSBADSCS作用基礎(chǔ)上，研究GO明膠水凝膠攜帶IRONS標(biāo)記的BADSCS在心梗心肌中的分布及分化影響規(guī)律，具體研究結(jié)果如下（1）IRONS對(duì)心肌細(xì)胞微結(jié)構(gòu)及生物活性影響共沉淀法制備IRONS，表面修飾巰基丁二酸23DIMERCAPTOSUCCINICACIDDMSA后制備DMSAIRONS。通過(guò)組織學(xué)染色及WESTERNBLOTTING等檢測(cè)，表明DMSAIRONS對(duì)心肌細(xì)胞微結(jié)構(gòu)分布影響較小。同時(shí)，在心肌細(xì)胞活性影響方面，體外33二氨基聯(lián)苯胺顏色反應(yīng)證明了DMSAIRONS能夠發(fā)揮類似過(guò)氧化酶的活性降低活性氧REACTIVEOXYGENSPECIESROS水平，DMSAIRONS在H2O2處理的心肌細(xì)胞內(nèi)同樣清除了部分ROS，對(duì)心肌細(xì)胞起到了保護(hù)作用。（2）DMSAIRONS對(duì)ECTS中閏盤結(jié)構(gòu)的影響在基于膠原MATRIGEL構(gòu)建的三維ECTS中，DMSAIRONS標(biāo)記后，透射電鏡及普魯士藍(lán)染色顯示細(xì)胞對(duì)DMSAIRONS的吸收與其在ECTS中的分布位置有關(guān)，ECTS邊緣的細(xì)胞大量攝取DMSAIRONS，而ECTS內(nèi)部細(xì)胞攝取較少，且內(nèi)吞的DMSAIRONS分布于細(xì)胞質(zhì)及囊泡中。在閏盤結(jié)構(gòu)形成方面，通過(guò)免疫熒光及WESTERNBLOTTING檢測(cè)，證實(shí)DMSAIRONS促進(jìn)ECTS中縫隙結(jié)構(gòu)的形成，降低粘著連接及橋粒的形成。（3）GO明膠水凝膠對(duì)BADSCS向心肌細(xì)胞分化影響研究制備含不同濃度GO的甲基丙烯酸酯明膠（GOGELMA）水凝膠，GO對(duì)水凝膠多孔狀結(jié)構(gòu)無(wú)明顯影響，但增加了水凝膠的電容性。通過(guò)結(jié)晶紫染色、MTT檢測(cè)等篩選出適合BADSCS粘附及細(xì)胞活性的GOGELMA水凝膠，同時(shí)GO的摻入未明顯影響B(tài)ADSCS的增殖，而免疫熒光染色、WESTERNBLOT檢測(cè)顯示，GOGELMA水凝膠明顯促進(jìn)了BADSCS向心肌細(xì)胞的分化及電傳導(dǎo)相關(guān)蛋白CONNEXIN43的極化分布及表達(dá)，并且誘導(dǎo)了ILKAKTERK12細(xì)胞信號(hào)的表達(dá)。（4）GOGELMA水凝膠攜帶摻雜鋅的氧化鐵磁納米粒標(biāo)記的BADSCS進(jìn)行的心梗治療研究利用熱分解鐵前體物質(zhì)的方法制備摻雜鋅的磁納米粒，經(jīng)DMSA表面修飾制備形成具有良好分散能力的磁納米粒，其大小為48±06NM。GOGELMA水凝膠攜帶磁納米粒標(biāo)記的BADSCS進(jìn)行大鼠心梗模型注射，經(jīng)心臟超聲、MRI技術(shù)、組織學(xué)染色等表明，GOGELMA水凝膠促進(jìn)了BADSCS在心梗區(qū)的存活、遷移及分化，并增加了心臟心室壁的厚度，改善了心臟的收縮功能。綜上，本研究首先明確DMSAIRONS對(duì)心肌細(xì)胞微結(jié)構(gòu)及細(xì)胞活性的影響，證實(shí)DMSAIRONS發(fā)揮類似過(guò)氧化物酶活性降低細(xì)胞內(nèi)ROS，對(duì)心肌細(xì)胞起到保護(hù)作用；利用三維ECTS研究模型，表明DMSAIRONS的攝取促進(jìn)縫隙連接的形成，降低心肌機(jī)械性能相關(guān)的粘著連接、橋粒斑蛋白表達(dá)。另外，在基于導(dǎo)電支架對(duì)BADSCS向心肌細(xì)胞分化規(guī)律與體內(nèi)心梗移植研究中，GOGELMA水凝膠增強(qiáng)BADSCS的伸展，促進(jìn)向心肌細(xì)胞分化的同時(shí)，誘導(dǎo)電傳導(dǎo)相關(guān)蛋白CONNEXIN43的表達(dá)及ILKAKTERK12信號(hào)，同時(shí)GOGELMA水凝膠攜帶BADSCS顯著增強(qiáng)心臟功能。本研究對(duì)未來(lái)IRONS及GO的ECTS構(gòu)建、標(biāo)記及體內(nèi)移植應(yīng)用奠定了研究基礎(chǔ)。

簡(jiǎn)介：QINGDAOAGRICULTURALUNIVERSITYTHETHESISOFPROFESSIONALMASTERSTUDYOFTHEPARTIALBIONOMICSANDSELECTIONOFDRUGSONEOVISGRADUATEWITHPROFESSIONALMASTERDEGREE‘‘’‘‘WANGL|IUANWANGMENTORPROFESSORKEDONGBISECONDMENTORRESEARCHERXIXIANGLITYPEOFPROFESSIONALDEGREEVETERINARYMEDICINEPROFESSIONALMASTERACADEMICFIELDCLINICALDIAGNOSISOFVETERINARIANDECEMBER,2009QINGDAO．CHINA青島農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士專業(yè)學(xué)位論文摘要山羊附紅細(xì)胞體部分生物學(xué)特性及藥物篩選試驗(yàn)的研究摘要本試驗(yàn)選擇發(fā)熱、貧血、黃疸癥狀明顯的山羊，通過(guò)鮮血壓片、血液涂片染色鏡檢和電鏡觀察等方法對(duì)山羊附紅細(xì)胞體形態(tài)學(xué)、運(yùn)動(dòng)學(xué)和染色特性等生物學(xué)特性進(jìn)行研究。結(jié)果表明鮮血壓片后光鏡下觀察J山羊附紅細(xì)胞體向任意方向作翻轉(zhuǎn)、扭轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)。姬姆薩氏染色和瑞氏染色后光鏡下觀察，紅細(xì)胞分別被染成藍(lán)色和粉紅色，附著在紅細(xì)胞上的山羊附紅細(xì)胞體都被染成紫紅色，且具有折光性改良瑞氏染色后光鏡下觀察，紅細(xì)胞被染成深紫色，山羊附紅細(xì)胞體被染成紫紅色吖啶橙染色后熒光顯微鏡下觀察，紅細(xì)胞為暗綠色，山羊附紅細(xì)胞體為發(fā)明亮熒光的綠色小體。為了篩選出治療山羊附紅細(xì)胞體的有效藥物，本試驗(yàn)在特定的培養(yǎng)條件下進(jìn)行了咪唑笨脲、磷酸伯氨喹、貝尼爾、四環(huán)素、咪唑苯J啄磷酸伯氨喹、咪唑苯脲貝尼爾、貝尼爾四環(huán)素等7種用藥方案對(duì)山羊附紅細(xì)胞體的體外藥物殺滅試驗(yàn)，經(jīng)綜合評(píng)價(jià)從中選擇2種體外殺滅效果最好的用藥方案，進(jìn)行山羊附紅細(xì)胞體病治療試驗(yàn)，通過(guò)治療前后臨床常規(guī)檢查、血液涂片鏡檢、血液生理生化指標(biāo)測(cè)定結(jié)果的綜合比較，確定治療山羊附紅細(xì)胞體痛的首選用藥方案。結(jié)果顯示山羊附紅細(xì)胞體體外藥物殺滅試驗(yàn)中咪唑苯脲磷酸伯氨喹、咪唑苯脲貝尼爾體外殺滅效果最好，且在有效濃度范圍內(nèi)對(duì)紅細(xì)胞的影響較輕微；貝尼爾四環(huán)素等效果也較好，但是對(duì)紅細(xì)胞的損傷較重，因此在治療山羊附紅細(xì)胞體病時(shí)首選咪唑苯脲磷酸伯氨喹、咪唑苯脲貝尼爾用藥方案在山羊附紅細(xì)胞體病治療試驗(yàn)申經(jīng)綜合評(píng)價(jià)咪唑苯脲磷酸伯氨喹藥物組對(duì)山羊附紅細(xì)胞體的治療效果略好于咪唑苯脲貝尼爾藥物組，且對(duì)機(jī)體的毒副作用低于咪唑苯脲，可首選咪唑苯脲磷酸伯氨喹聯(lián)合藥物治療山羊附紅細(xì)胞體病。關(guān)鍵詞山羊附紅細(xì)胞體；病原學(xué)；治療；體外殺滅

簡(jiǎn)介：THESTUDIESOFTHEBIOLOGICALPROPERTIESOFJAPANESEENCEPHALITISVACCINEMUTANTANDTHEGENOMECHARACTERIZATIONOFAPREVALENTSTRAINOFDUCKTEMBUSUVIRUSBVJINGMANWANGSUPERVISORPROF．PUYANCHENATHESISSUBMITTEDTONANJINGAGRICULTURALUNIVERSITYINPARTIALFULFILLMENTOFTHEREQUIREMENTFORTHEPHILOSOPHYDEGREEOFAGRONOMY目錄目錄摘要??????????????????????????????????????．IABSTRACT???????????????????????????????????????????????．V縮略語(yǔ)?????????????????????????????????????．．XI第一篇文獻(xiàn)綜述?????????????????????????????????1第一章日本腦炎病毒及其與宿主相互作用概述????????????????????．11日本腦炎的流行特征?????????????????????????????12日本腦炎的病原特征?????????????????????????????32．1病毒粒子的性質(zhì)?????????????????．???????????32．2JEV的基因結(jié)構(gòu)????????????????????????????一42．3JEV結(jié)構(gòu)蛋白特征???????????????????????????．．72．4JEV非結(jié)構(gòu)蛋白特征???????????????????????????92．5JEV毒力基礎(chǔ)?????????????????????????????133厄V的傳播特征???????????????????????????????144厄V的致病機(jī)制???????????????????????????????L55JEV疫苗的研究進(jìn)展?????????????????????????????165．1鼠腦組織的滅活疫苗??????????????????????????175．2細(xì)胞培養(yǎng)的弱毒疫苗??????????????????????????175．3細(xì)胞培養(yǎng)的滅活疫苗??????????????????????????185．4基因工程嵌合弱毒活疫苗????????????????????????185．5其他疫苗???????????????????????????????186宿主針對(duì)JEV免疫防御???????????????????????????．196．1先天性免疫防御????????????????????????????196．2適應(yīng)性免疫防御????????????????????????????197日本腦炎病毒對(duì)宿主的免疫逃逸???????????????????????一207．1JEV抑制干擾素通路??????????????????????????．207．2JEV抑制NK細(xì)胞的免疫監(jiān)測(cè)和細(xì)胞毒性作用???????????????．217．3JEV活化自噬進(jìn)行免疫逃逸???????????????????????．21參考文獻(xiàn)??????????????????????????????????一23第二部分實(shí)驗(yàn)研究???????????????????????????????一39第二章日本腦炎病毒E279對(duì)其蝕斑形態(tài)和致病力的作用研究．．．????????????．39

簡(jiǎn)介：鈉泵NAKATPASE是哺乳類生物細(xì)胞膜上普遍存在的一種介導(dǎo)離子轉(zhuǎn)運(yùn)的跨膜載體蛋白，它由Α、Β、Γ三個(gè)亞單位組成，其中Α亞基具有酶的活性。Α亞基有Α1、Α2、Α3、Α4四種亞型，各個(gè)亞型的基本結(jié)構(gòu)高度保守，都有10個(gè)跨膜區(qū)即M1M10。其膜外區(qū)序列含有多種鈉泵調(diào)節(jié)因子的結(jié)合位點(diǎn)，包括內(nèi)源性鈉泵抑制劑哇巴因的結(jié)合位點(diǎn)。目前認(rèn)為，Α亞基的第二個(gè)跨膜區(qū)M3M4是哇巴因的一個(gè)重要結(jié)合位點(diǎn)。哇巴因與鈉泵結(jié)合后，抑制鈉泵活性，進(jìn)而促使血壓升高。因此，本研究將從噬菌體隨機(jī)肽庫(kù)中篩選鈉泵Α1亞基M3M4膜外區(qū)特異性結(jié)合肽，通過(guò)此結(jié)合肽來(lái)封閉哇巴因M3M4結(jié)合位點(diǎn)，競(jìng)爭(zhēng)抑制哇巴因與鈉泵的結(jié)合，并通過(guò)檢測(cè)此鈉泵結(jié)合肽對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞和SHR大鼠血壓的作用，進(jìn)一步探討鈉泵與其抑制因子的可能作用機(jī)制，為高血壓的治療提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。一、鈉泵Α1亞基M3M4膜外區(qū)結(jié)合肽的篩選目的以鈉泵Α1亞基M3M4膜外區(qū)蛋白為靶標(biāo)，從噬菌體隨機(jī)12肽庫(kù)中篩選出能與之特異性結(jié)合的多肽，以拮抗哇巴因?qū)︹c泵的抑制作用，并檢測(cè)此特異性結(jié)合短肽與哇巴因是否競(jìng)爭(zhēng)抑制關(guān)系。方法1以鈉泵Α1亞基M3M4膜外區(qū)序列ILEYTWLEAGGGS為靶蛋白，利用噬菌體隨機(jī)12肽庫(kù)技術(shù)，通過(guò)3輪“吸附洗脫擴(kuò)增”的淘選，使與靶蛋白特異性結(jié)合的噬菌體得到大量富集。2雙夾心ELISA實(shí)驗(yàn)鑒定噬菌體陽(yáng)性克隆以鈉泵Α1亞基M3M4膜外區(qū)序列ILEYTWLEAGGGS包被ELISA板，同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照，加入隨機(jī)挑選的30個(gè)噬菌體原種上清，加HRP抗M13抗體，顯色后于420NM測(cè)定OD值。3濃度依賴性實(shí)驗(yàn)以鈉泵Α1亞基M3M4膜外區(qū)序列ILEYTWLEAGGGS為靶蛋白，每個(gè)待鑒定克隆包被8個(gè)孔，將噬菌體克隆擴(kuò)增后測(cè)定滴度，加入～1012PFU的噬菌體并進(jìn)行5倍系列稀釋，加入HRP抗M13抗體，顯色后測(cè)定OD值，以稀釋倍數(shù)對(duì)吸光度作圖。4噬菌體SSDNA的提取及序列分析采用M13噬菌體SSDNA快速提取試劑盒提取噬菌體SSDNA，測(cè)序后，根據(jù)“隨機(jī)十二肽GⅢ融合蛋白的N末端序列”，確定插入片段的基因序列，參照“遺傳密碼表”翻譯出篩選多肽序列。5畦巴因競(jìng)爭(zhēng)性抑制試驗(yàn)將待鑒定的噬菌體上清進(jìn)行2倍系列稀釋，各取50ΜL與50ΜL100ΜGML哇巴因混勻，放入已包被靶蛋白的酶聯(lián)板中，同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照，加入HRP抗M13抗體，顯色后測(cè)定OD值，以稀釋倍數(shù)對(duì)吸光度作圖。結(jié)果1噬菌體隨機(jī)12肽庫(kù)篩選結(jié)果3輪生物篩選中，陽(yáng)性噬菌體的產(chǎn)出與投入比率逐輪提高，表明篩選出的噬菌體得到了選擇性的富集。2雙夾心ELISA實(shí)驗(yàn)隨機(jī)挑選的30個(gè)噬菌體克隆中21個(gè)樣品孔與陰性對(duì)照孔OD比值≥21，確定為陽(yáng)性克隆。3濃度依賴性實(shí)驗(yàn)從稀釋倍數(shù)對(duì)吸光度的圖中看出，21個(gè)陽(yáng)性克隆均具有濃度依賴性，提示有較好的親和力。4噬菌體SSDNA的提取及序列分析提取21個(gè)噬菌體克隆的SSDNA，進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果顯示，目的條帶7500BP左右與噬菌體DNA大小相符。測(cè)序結(jié)果表明，21個(gè)陽(yáng)性噬菌體包含3種結(jié)合短肽，分別為肽ASWYQEGPSTQPE一致率達(dá)476％1021。肽BSSNTAWQNMTSL一致率為286％621。肽CGENPWENVAVAM一致率為238％521，合成肽A作為鈉泵結(jié)合肽。5哇巴因競(jìng)爭(zhēng)性抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，相同濃度的噬菌體上清，在哇巴因存在的情況下，其OD值比陰性對(duì)照降低；隨著噬菌體上清中結(jié)合肽濃度的降低，其對(duì)哇巴因與靶蛋白結(jié)合的競(jìng)爭(zhēng)力亦逐漸降低，說(shuō)明結(jié)合肽與哇巴因是競(jìng)爭(zhēng)抑制關(guān)系，篩選到的結(jié)合肽能夠特異性地與鈉泵Α1亞基M3M4膜外區(qū)的表位識(shí)別位點(diǎn)結(jié)合。結(jié)論以鈉泵Α1亞基M3M4膜外區(qū)序列ILEYTWLEAGGGS為靶蛋白，從噬菌體隨機(jī)十二肽庫(kù)中成功獲得了能夠與之特異性結(jié)合的多肽SWYQEGPSTQPE。為進(jìn)一步探討鈉泵與哇巴因的作用機(jī)制及高血壓的治療奠定了基礎(chǔ)。二、鈉泵結(jié)合肽的生物學(xué)活性分析目的檢測(cè)鈉泵結(jié)合肽對(duì)哇巴因刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖或凋亡的影響，并檢測(cè)鈉泵結(jié)合肽對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠SHR血壓的影響，探討該鈉泵結(jié)合肽在高血壓病治療中的應(yīng)用價(jià)值。方法1MTT法檢測(cè)鈉泵結(jié)合肽對(duì)生理濃度的哇巴因刺激EAHY926血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響取96孔板各組細(xì)胞，分別加入生理濃度03109，06109，09109MOLL的哇巴因及106MOLL的鈉泵結(jié)合肽，以不加鈉泵結(jié)合肽組為陰性對(duì)照。培養(yǎng)24、48、72H后，加20ΜLMTT，繼續(xù)培養(yǎng)4H后，棄上清，加入DMSO，于酶標(biāo)儀測(cè)定570NM處吸光度值。2用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)鈉泵結(jié)合肽對(duì)高濃度哇巴因刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響取完全貼壁的各瓶細(xì)胞，分別加入高濃度104，106MOLL的哇巴因及104MOLL的鈉泵結(jié)合肽，以不加鈉泵結(jié)合肽組為陰性對(duì)照。培養(yǎng)24H后，離心收集細(xì)胞，70％的冷乙醇固定，4℃冰箱存放。加入碘化丙啶PI染色30MIN后，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡百分率。3鈉泵結(jié)合肽對(duì)SHR大鼠血壓的影響給藥組SHR大鼠尾靜脈注射2MGKG鈉泵結(jié)合肽，于給藥后15MIN，30MIN，45MIN，60MIN分別測(cè)量大鼠的血壓值并記錄，以注射生理鹽水組為陰性對(duì)照。結(jié)果1MTT法檢測(cè)鈉泵結(jié)合肽對(duì)生理濃度的哇巴因刺激EAHY926血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響哇巴因濃度為06109MOLL時(shí)，對(duì)細(xì)胞有最大增殖作用P＜005，且在此基礎(chǔ)上，加上鈉泵結(jié)合肽后，細(xì)胞的增殖率較哇巴因單獨(dú)存在時(shí)有所降低，24H、48H、72H分別降低1024％、1835％、1618％。2用流式細(xì)胞儀檢測(cè)鈉泵結(jié)合肽對(duì)高濃度哇巴因刺激EAHY926內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響結(jié)果顯示，高濃度哇巴因104MOLL、106MOLL均可刺激EAHY926細(xì)胞發(fā)生凋亡，且具有顯著性差異P＜001，當(dāng)加入104MOLL鈉泵結(jié)合肽時(shí)，106MOLL哇巴因組的細(xì)胞凋亡率顯著下降P＜001。3SHR大鼠尾靜脈注射2MGKG鈉泵結(jié)合肽后，其血壓開始逐漸下降，到第15MIN血壓出現(xiàn)最低值，由原來(lái)水平2032±528MMHG降至1798±483MMHG，較原水平降低115％，隨后逐漸上升，到60MIN左右血壓基本恢復(fù)到給藥前水平。結(jié)論篩選到的鈉泵結(jié)合肽能夠拮抗哇巴因?qū)︹c泵的結(jié)合，影響哇巴因誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖或凋亡，并且能夠引起SHR大鼠血壓下降，提示鈉泵結(jié)合肽可作為降壓藥研究的一個(gè)新方向。

簡(jiǎn)介：畜禽種質(zhì)資源是維持生態(tài)安全、農(nóng)業(yè)穩(wěn)定的重要資源，它推動(dòng)著經(jīng)濟(jì)的繁榮與社會(huì)的進(jìn)步。重要的家養(yǎng)動(dòng)物種質(zhì)資源應(yīng)該受到重視，并得到有效的保護(hù)。間充質(zhì)干細(xì)胞可以在體外快速增殖并且可以向其他細(xì)胞分化。這些優(yōu)點(diǎn)使得它們成為畜禽種質(zhì)資源保存研究的新渠道。本實(shí)驗(yàn)以肉雞真皮來(lái)源和鵝心臟來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，在體外對(duì)細(xì)胞進(jìn)行了分離培養(yǎng)、生物學(xué)特性研究和誘導(dǎo)分化研究，并得到以下結(jié)果1利用膠原酶Ⅰ和胰蛋白酶分離得到肉雞真皮間充質(zhì)干細(xì)胞DERMALMESENCHYMALSTEMCELLS，DMSCS并在體外條件下培養(yǎng)31代，細(xì)胞形態(tài)主要為長(zhǎng)梭形。RTPCR鑒定結(jié)果顯示，細(xì)胞表達(dá)CD73、CD29、CD44，和CD71基因。免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)結(jié)果顯示肉雞DMSCS陽(yáng)性表達(dá)CD105、CD90、CD73和CD44表面標(biāo)記物。通過(guò)流式細(xì)胞儀分析，CD29、CD44和CD73在肉雞DMSCS中高表達(dá)。DMSCS的生長(zhǎng)曲線為明顯的“S”形，與細(xì)胞在體外增殖的通常規(guī)律基本吻合。DMSCS的群體倍增時(shí)間和克隆形成能力的結(jié)果表明細(xì)胞的增殖能力隨著代次的升高而減弱。研究表明肉雞DMSCS能夠在一定的條件下被分化為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞，通過(guò)特異性染色和RTPCR鑒定證明肉雞DMSCS向這三種細(xì)胞成功分化。2利用膠原酶Ⅱ和胰蛋白酶分離得到鵝心臟間充質(zhì)干細(xì)胞HEARTDERIVEDMESENCHYMALSTEMCELLS，HMSCS，并在體外培養(yǎng)21代，細(xì)胞形態(tài)特征呈現(xiàn)梭狀。RTPCR和免疫組化檢測(cè)檢測(cè)結(jié)果都顯示細(xì)胞表達(dá)CD29，CD34，CD73，CD166和CD44等MSCS特異基因。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析，CD29，CD34，CD73，CD166和CD44在鵝HMSCS中高表達(dá)。HMSCS的生長(zhǎng)曲線表明HMSCS經(jīng)過(guò)短暫潛伏期，進(jìn)入迅速增殖的對(duì)數(shù)期，而后進(jìn)入穩(wěn)定期和衰亡期，呈現(xiàn)出明顯的“S”形，與細(xì)胞體外生長(zhǎng)的基本規(guī)律吻合。群體倍增時(shí)間結(jié)果表明HMSCS的增殖能力隨著代次的升高逐漸減弱。通過(guò)在培養(yǎng)基中加入適當(dāng)?shù)恼T導(dǎo)因子對(duì)HMSCS進(jìn)行體外誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)，通過(guò)特異性染色和RTPCR等方法對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，HMSCS成功被分化為成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和軟骨細(xì)胞，說(shuō)明鵝HMSCS可以向多個(gè)方向誘導(dǎo)。綜上所述，本實(shí)驗(yàn)成功分離培養(yǎng)了肉雞DMSCS和鵝HMSCS，并且對(duì)它們進(jìn)行了生物學(xué)特性研究和誘導(dǎo)分化研究。結(jié)果顯示，肉雞DMSCS和鵝HMSCS均表現(xiàn)出MSCS特有的生物學(xué)特性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)畜禽種質(zhì)資源保存具有重要的意義，并且為再生醫(yī)學(xué)和組織工程學(xué)提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

簡(jiǎn)介：研究背景前交叉韌帶（ANTERICRUCIATELIGAMENTACL）損傷是青壯年尤其是競(jìng)技體育運(yùn)動(dòng)者中最常見(jiàn)的膝關(guān)節(jié)韌帶損傷之一。臨床上以ACL重建術(shù)為其治療的主要方法。但ACL重建術(shù)并不能降低ACL損傷所繼發(fā)的創(chuàng)傷性關(guān)節(jié)炎POSTTRAUMATICOSTEOARTHRITIS，PTOA發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)和進(jìn)程。最新的研究表明，在關(guān)節(jié)創(chuàng)傷后一周內(nèi)關(guān)節(jié)腔即出現(xiàn)大量的炎癥因子及氧自由基等，促使大量的軟骨細(xì)胞凋亡，成為啟動(dòng)PTOA關(guān)節(jié)軟骨退變和損傷的始動(dòng)因素。因此及早抑制這些炎性因子的活性對(duì)阻止或者減緩PTOA的發(fā)展至為關(guān)鍵。Α2巨球蛋白ALPHA2MACROGLOBULIN，A2M作為一種廣譜的蛋白酶抑制劑在關(guān)節(jié)軟骨損傷時(shí)被合成和分泌到關(guān)節(jié)液中，可有效地抑制IL1誘導(dǎo)軟骨基質(zhì)降解的基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP3、9、13）和多種炎癥因子（IL1Β、6、8TNFA和GMCSF）的活性，但其在關(guān)節(jié)軟骨損傷后血清和關(guān)節(jié)液中分泌情況卻一直未見(jiàn)相關(guān)研究。本課題組在前期研究中也已經(jīng)證實(shí)采用前交叉韌帶切斷術(shù)（ANTERICRUCIATELIGAMENTTRANSECTION，ACLT）制作的SD大鼠的創(chuàng)傷性關(guān)節(jié)炎PTOA模型中，適量的補(bǔ)充外源性的A2M可以明顯的減緩關(guān)節(jié)軟骨的退變進(jìn)程，具有非常顯著的正性關(guān)節(jié)軟骨保護(hù)作用。但所使用的A2M為大分子量蛋白質(zhì)，免疫原性強(qiáng)，異種A2M長(zhǎng)期關(guān)節(jié)腔注射極有可能引起免疫反應(yīng)，因此尋求一種更加簡(jiǎn)單的提純或富含A2M血清的方法并觀察其對(duì)創(chuàng)傷性關(guān)節(jié)炎（PTOA）的治療效果具有非常重要臨床價(jià)值。研究目的1）分析A2M在ACL損傷時(shí)血清、關(guān)節(jié)液中的分布變化，明確與關(guān)節(jié)軟骨退化存在的關(guān)聯(lián)為外源性補(bǔ)充A2M提供理論依據(jù)；2）采用超濾離心法制備富含A2M血清（A2MRICHSERUM，A2MRS），檢測(cè)A2MRS中的A2M的蛋白濃度及蛋白活性，并分析其分子生物學(xué)特性；3）觀察富含A2M血清（A2MRICHSERUM，A2MRS）對(duì)創(chuàng)傷性關(guān)節(jié)炎（PTOA）的關(guān)節(jié)軟骨是否具有明顯的治療效果或減緩關(guān)節(jié)軟骨退化的作用。研究方法1）首先以2月齡96只SD大鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，分為兩組，每組48只。實(shí)驗(yàn)組通過(guò)前交叉韌帶切斷術(shù)（ANTERICRUCIATELIGAMENTTRANSECTION，ACLT）建立PTOA動(dòng)物模型，對(duì)照組采取假手術(shù)切開，不行ACLT。術(shù)后3天及1、2、4、8及12周每個(gè)時(shí)間點(diǎn)各組處死8只大鼠，收集血清及膝關(guān)節(jié)盥洗液。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)大鼠ACL損傷后不同時(shí)間點(diǎn)的關(guān)節(jié)盥洗液、血清中A2M的濃度變化規(guī)律，同時(shí)采用番紅O固綠染色觀察PTOA隨著時(shí)間的延長(zhǎng)其關(guān)節(jié)軟骨退化的病理進(jìn)程與體液中A2M的含量變化是否存在某種關(guān)聯(lián)，探討A2M是否可以作為關(guān)節(jié)軟骨退變?cè)缙谠\斷及監(jiān)測(cè)病理進(jìn)程的生物標(biāo)記物為外源性補(bǔ)充A2M提供理論依據(jù)。2）采用超濾離心法制備富含A2M血清（A2MRICHSERUMA2MRS），采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）、蛋白免疫印跡法（WESTERNBLOT）等方法檢測(cè)其分子生物學(xué)性質(zhì)。3）選取80只健康成年SD大鼠分為4組，每組20只SHAMSALINE（空白對(duì)照組）、ACLTHA2MRS（高劑量組）、ACLTLA2MRS（低劑量組）、ACLTSALINE（陽(yáng)性對(duì)照組）。手術(shù)后3天、2周、4周依據(jù)分組的不同關(guān)節(jié)腔定時(shí)注射30UL生理鹽水或30UL不同濃度A2MRS高劑量組A2M為20UGUL低劑量組A2M為10UGUL。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)治療后24小時(shí)關(guān)節(jié)腔注射MMP680免疫熒光探針，采用熒光分子斷層成像系統(tǒng)（FLUESCENCEMOLECULARTOMOGRAPHY，F(xiàn)MT）動(dòng)態(tài)檢測(cè)基質(zhì)金屬蛋白酶MATRIXMETALLOPROTEINASE，MMP）在關(guān)節(jié)液中濃度的變化，觀察A2MRS對(duì)基質(zhì)金屬蛋白酶是否具有抑制作用。術(shù)后8周統(tǒng)一處死動(dòng)物，小動(dòng)物X線片觀察膝關(guān)節(jié)退變的影像學(xué)表現(xiàn)，印度墨水染色評(píng)估關(guān)節(jié)軟骨大體損傷情況，并行MANKIN’S評(píng)分；脛骨平臺(tái)關(guān)節(jié)軟骨采用甲苯胺藍(lán)、番紅O固綠染色、蘇木精伊紅染色（HE染色）和免疫組化法觀察A2MRS對(duì)PTOA軟骨病理退變是否具有減緩或者修復(fù)作用，采用OARIS評(píng)分系統(tǒng)評(píng)估關(guān)節(jié)軟骨的病理變化并作統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；股骨髁關(guān)節(jié)軟骨采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法（RTPCR）對(duì)軟骨組織中II型膠原COLII、X型膠原（COLX）、基質(zhì)金屬蛋白酶3、13（MATRIXMETALLOPROTEINASE，MMP3、13）、軟骨聚集蛋白聚糖（AGGRECAN）、RUNT蛋白相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2（RUNTRELATEDTRANIONFACTRUNX2等指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)，評(píng)估富含A2M血清對(duì)關(guān)節(jié)軟骨損傷在基因?qū)用嫔系恼{(diào)控作用。采用ELISA檢測(cè)關(guān)節(jié)液中基質(zhì)金屬蛋白酶（MATRIXMETALLOPROTEINASE，MMP13）濃度。結(jié)果1ACLT術(shù)后實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的關(guān)節(jié)軟骨早期大體觀察與組織病理學(xué)觀察并無(wú)明顯的區(qū)別，但術(shù)后8周開始，實(shí)驗(yàn)組的關(guān)節(jié)軟骨退化明顯加重。實(shí)驗(yàn)組術(shù)后3天、1周、8周關(guān)節(jié)盥洗液中A2M的濃度較血清中的濃度明顯增高。并且實(shí)驗(yàn)組術(shù)后3天關(guān)節(jié)液盥洗液中的A2M的濃度與對(duì)照組關(guān)節(jié)盥洗液中A2M濃度相比較明顯增高，術(shù)后1周開始迅速降低與對(duì)照組無(wú)差別。2采用超濾離心法制備的富含A2M血清（A2MRICHSERUMA2MRS）經(jīng)ELISA檢測(cè)結(jié)果為人的血清中A2M的濃度為243±066MGML富含A2M血清（A2MRS）中A2M的濃度為1952±437MGMLA2MRS中的A2M的濃度較正常血清中的濃度提高了804倍。蛋白免疫印跡（WESTERNBLOT）結(jié)果顯示富含A2M血清（A2MRS）相比正常血清在180KD處有非常明顯的蛋白濃聚現(xiàn)象。A2M蛋白活性檢測(cè)表明富含A2M血清（A2MRS）的A2M蛋白活性較正常血清A2M的活性提高213倍。3動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)觀察A2MRS對(duì)PTOA關(guān)節(jié)軟骨退化的治療作用，通過(guò)熒光分子斷層成像系統(tǒng)（FLUESCENCEMOLECULARTOMOGRAPHY，F(xiàn)MT）檢測(cè)結(jié)果表明富含A2M血清（A2MRS）早期可以明顯抑制創(chuàng)傷性關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)液中基質(zhì)金屬蛋白酶3、13（MATRIXMETALLOPROTEINASE，MMP3、13）。膝關(guān)節(jié)的X光片的影像學(xué)表現(xiàn)ACLTSALINE組的髕骨下緣有明顯的骨贅增生，其余三組在影像學(xué)表現(xiàn)上均沒(méi)有觀察到明顯的退行性改變。印度墨水染色表明SHAMSALINE組中軟骨表面未見(jiàn)明顯損傷，ACLTSALINE組軟骨表面損傷最為嚴(yán)重，而ACLTA2MRS組關(guān)節(jié)面損傷明顯減輕，其中ACLTHA2MRS組中軟骨損傷在ACL切斷組中最小，改良MANKINS評(píng)分顯示ACLTHA2MRS組和ACLTLA2MRS與ACLTSALINE組相比較均有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但ACLTHA2MRS組與ACLTLA2MRS組相比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。脛骨平臺(tái)番紅O固綠染色、HE染色及甲苯胺藍(lán)染色結(jié)果均顯示ACLTSALINE組軟骨厚度明顯變薄，軟骨表面有較多小的裂隙，軟骨細(xì)胞分布紊亂，糖胺多糖染色較差。ACLTLA2MRS組軟骨細(xì)胞聚集成團(tuán)，軟骨厚度降低，ACLTHA2MRS組中軟骨表面較為平滑，細(xì)胞排列較整齊，SHAMSALINE組軟骨表面完整，結(jié)構(gòu)良好，細(xì)胞分布均勻，糖胺多糖染色良好。OARIS評(píng)分顯示ACLTSALINE組為1015±288，ACLTHA2MRS組為554±261ACLTLA2MRS組為487±274，SHAMSALINE為305±139，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組（ACLTHA2MRS和ACLTLA2MRS）與陽(yáng)性對(duì)照組（ACLTSALINE）均有顯著性差異（P在II型膠原的免疫組化染色上，ACLTHA2MRS組和ACLTLA2MRS組的陽(yáng)性細(xì)胞明顯比ACLTSALINE組染色強(qiáng)，即ACLTHA2MRS組較ACLTLA2MRS組陽(yáng)性細(xì)胞要強(qiáng)，但兩組II型膠原的免疫組化染色均低于SHAMSALINE組。在X型膠原和MMP13的免疫組化染色上，ACLTSALINE組陽(yáng)性細(xì)胞在四組中表達(dá)最強(qiáng)，SHAMSALINE組的陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)最弱，而兩個(gè)治療組ACLTHA2MRS組及ACLTLA2MRS組在X型膠原表達(dá)上介于ACLTSALINE組與SHAMSALINE組之間，并且同樣存在劑量依賴性，即ACLTHA2MRS的X型膠原的表達(dá)比ACLTLA2MRS組弱。RTPCR結(jié)果表明A2MRS具有較為明顯的抑制負(fù)性基因X型膠原（COLX）、基質(zhì)金屬蛋白酶3、13（MATRIXMETALLOPROTEINASE3、13，MMP3、13）、RUNT蛋白相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2（RUNTRELATEDTRANIONFACTRUNXN2的MRNA表達(dá)。關(guān)節(jié)液中MMP13的ELISA測(cè)定結(jié)果表明ACLTHA2MRS組、ACLTLA2MRS組與SHAMSALINE組中關(guān)節(jié)液中MMP13濃度均顯著低于ACLTSALINE統(tǒng)計(jì)學(xué)分析有顯著性差異，但前三組之間組相比均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)論1關(guān)節(jié)液中A2M可以作為生物標(biāo)記物早期診斷創(chuàng)傷性關(guān)節(jié)炎，術(shù)后一周關(guān)節(jié)液中A2M的迅速降低提示外源性的補(bǔ)充至關(guān)重要。2超濾離心法可高效便捷的制備具有較高蛋白濃度和蛋白活性的富含A2M血清。3富含A2M血清（A2MRS）具有較為明顯減緩關(guān)節(jié)軟骨退化的正性治療作用。

簡(jiǎn)介：獨(dú)創(chuàng)性聲明本人聲明所呈交的學(xué)位論文是本人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作及取得的研究成果。據(jù)我所知，除了文中特別加以標(biāo)注和致謝的地方外，論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫過(guò)的研究成果，也不包含為獲得安徽大學(xué)或其他教育機(jī)構(gòu)的學(xué)位或證書而使用過(guò)的材料。與我一同工作的同志對(duì)本研究所做的任何貢獻(xiàn)均已在論文中作了明確的說(shuō)明并表示謝意。學(xué)位論文作者簽名冰V7鑫簽字日期O3年易月F日學(xué)位論文版權(quán)使用授權(quán)書本學(xué)位論文作者完全了解安徽大學(xué)有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，有權(quán)保留并向國(guó)家有關(guān)部門或機(jī)構(gòu)送交論文的復(fù)印件和磁盤，允許論文被查閱和借閱。本人授權(quán)安徽大學(xué)可以將學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索，可以采用影印、縮印或掃描等復(fù)制手段保存、匯編學(xué)位論文。學(xué)位論文作者簽名參妒矗導(dǎo)師簽名7幣∥掃鼉簽字日期如吟年6月1日簽字日期。7硝年占月I日ABSTRACTABSTRACTINPLANTS，ALGAE，ANDMOSTBACTMLIA，TETRAPYRROLEBIOSYNTHESISPROVIDESIMPOZ‘TANTPIGMENTSINCLUDINGCHOROPHYLLANDHEINEAKEYI‘EGULATORYMECHANISMOFTETRAPYRROLEBIOSYNTHESISISTHEMETABOLICFEEDBACKINHIBITIONOFGLUTAMYLTRNAREDUCTASEGIUTRBYHEMEGIUTRISTHERATELIMITINGENZYMEFORTETRAPYRROLEBIOSYNTHESISANDINTHEDARKCONDITIONFLUCANSUPPRESSGIUTRACTIVITYBYNEGATIVELYREGULATINGANDDIRECTLYINTERACTINGWITHGIUTRRECOMBINANTFLUANDGLUTRPROTEINSWEREOBTAINEDBYPROKARYOTICEXPRESSION，F(xiàn)OLLOWEDBYNINTAAFFINITYCHROMATOGRAPHYANDSIZEEXCLUSIONCHROMATOGRAPHYHIGHPURLTYOFFLUANDFLUGLUTRCOMPLEXWEREOBTAINED，ANDTHROUGHCRYSTALSCREENINGANDOPTIMIZATION，THEIRCRYSTALSWEREGROWNUSINGMOLECULARREPLACEMENTMETHOD，STRUCTUREOFTHEFLUTPRDOMAINWASSUCCESSFULLYDETERMINEDANDREFINEDTOARESOLUTIONOF145ASTRUCTUREOFTHEFLUTPRDOMAININCOMPLEXWITHTHEGIUTRDIMERICDOMAINWASTHENSOLVEDBYUSINGTHEFLUTPRDOMAINASSEARCHMODEL，ANDREFINEDTOARESOLUTIONOF24HTHEFLUTPRDOMAINSTRUCTURESHOWSTHATITCONSISTSOFTHREENONCANONICALTPRMOTIFS，ANDFORMSDIMERSTHROUGHTPR3ALA262INTPR2ISONEOFTHEFEWABSOLUTELYCONSERVEDAMINOACIDRESIDUES，ANDITSMUTATIONWILLLEADTOLETHALPHENOTYPEINARABIDOPSISTHALIANATHE24ACOMPLEXSTRUCTUREDISPLAYSTHATFLUANDGLUTRINTERACTATA22RATIOANDFLUBINDSTOTHEGTUTRDIMERICDOMAINTHROUGHTPRIANDTPR3THISINTERACTIONOCCURSTHROUGHFIVESALTBRIDGESANDAHYDROGENBONDTHEITCEXPERIMENTSEVALUATETHEEFFECTSOFKEYAMINOACIDRESIDUESFORTHEFLUGIUTRINTERACTIONFORGLUTRINHIGHERPLANTS，ITSCTERMINALREGIONISVERYIMPORTANTFORITSACTIVITYREGULATION，ANDTHESTRUCTURALINTE口ITYOFAGIUTRDIMERISREQUIREDTHEINTERACTIONWITHFLUFLUANDGIUTRCANFLONLLASTABLECOMPLEXIN’，ILROGIUTRLACKINGTILECTERMINAII5AMINOACIDRESIDUESCANFORNLADIMERANDCALLINTERACTWITHFLUANINVITROACTIVITYASSAYSHOWSTHATGLUTRACTIVIT3’ISSIGNIFICANTLYINHIBITEDINTHEIV

簡(jiǎn)介：分類號(hào)密級(jí)華中農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文感染豬鏈球菌2型后細(xì)胞因子的變化以及分泌核酸酶A的生物學(xué)研究CHANGESOFCYTOKINESEXPRESSIONPROGILEINPIGSINFEETEDBYSTREPTOEOCCUSSUISTYPE2ANDBIOLOGIEPROERTYSTUDYOFSEERETEDNUCIEASEA研究生康超指導(dǎo)教師金梅林教授指導(dǎo)小組陳煥春教授金梅林教授郭愛(ài)珍教授周銳教授貝為成副教授專業(yè)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)獲得學(xué)位名稱農(nóng)學(xué)碩士研究方向動(dòng)物傳染病獲得學(xué)位時(shí)間2008年6月華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院二00八年六月華中農(nóng)業(yè)大學(xué)2008屆碩士學(xué)位論文226引物設(shè)計(jì)，合成和融解曲線的檢測(cè)23227。DNAPCR擴(kuò)增鑒定和RNA樣品中DNA檢鋇L24228熒光定量反應(yīng)24229數(shù)據(jù)處理243結(jié)果2531豬的臨床癥狀2532CDNAPCR擴(kuò)增鑒定和RNA樣品中DNA檢測(cè)2533熒光定量PCR的融解曲線，2634熒光定量PCR擴(kuò)增細(xì)胞因子結(jié)果274討論2941DNA的定量的研究，2942各個(gè)細(xì)胞因子MRNA的表達(dá)305小結(jié)31第三章分泌核酸酶SSNA的生物學(xué)特性研究咒1前言322材料和方法3221材料，32211菌株及質(zhì)粒，犯212酶及主要試劑，32213一抗和二抗33214免疫動(dòng)物34215主要試劑及溶液的配制34216細(xì)菌培養(yǎng)基34217質(zhì)粒抽提相關(guān)溶液34218SDS一PAGE相關(guān)溶液35219WESTEM一BLOT及蛋白質(zhì)斑點(diǎn)雜交緩沖液3521IOELISA相關(guān)溶液362111其他3622方法37221弓1物設(shè)計(jì)37222基因組DNA的提取37223分泌核酸酶SSNA基因的克隆37224PCR產(chǎn)物的回收與純化，38225PCR產(chǎn)物與PET28A載體的連接38226感受態(tài)細(xì)胞的制備氯化鈣法38227連接產(chǎn)物及質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化39228質(zhì)粒的小量制備堿裂解法39229重組表達(dá)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化和鑒定392210大腸桿菌BLZIDE3的誘導(dǎo)表達(dá)392211確定最佳的誘導(dǎo)表達(dá)條件、402212小量誘導(dǎo)402213大量誘導(dǎo)402214多克隆抗體的制備4022141免疫原的制備40

簡(jiǎn)介：目的乙型肝炎病毒感染可引起急性、慢性肝炎、肝硬化和肝細(xì)胞癌，是重大的公共衛(wèi)生問(wèn)題。臨床上，通過(guò)檢測(cè)HBV血清標(biāo)志物來(lái)輔助判斷HBV感染與否、評(píng)價(jià)預(yù)后、治療方案和藥物反應(yīng)等。HBSAG是感染乙型肝炎病毒后最早出現(xiàn)在血液中的標(biāo)志物，具有較強(qiáng)的免疫原性，是檢測(cè)乙型肝炎病毒感染情況的最重要的指標(biāo)之一。本課題目的為應(yīng)用分子生物學(xué)方法構(gòu)建抗HBSAG抗體并研究其生物學(xué)功能。方法實(shí)驗(yàn)室前期工作篩得一株抗HBSAG單鏈抗體，我們構(gòu)建了全抗體LPCDNA31HPCDNA31真核表達(dá)載體，然后將其轉(zhuǎn)染至293F細(xì)胞株，成功表達(dá)純化了抗HBSAG抗體HB192，應(yīng)用ELISA方法測(cè)定抗體的結(jié)合活性，通過(guò)測(cè)定HEPG2215細(xì)胞培養(yǎng)上清HBSAG的含量和HBVDNA拷貝數(shù)評(píng)估抗HBSAG抗體HB192的中和乙肝病毒的能力。結(jié)果我們成功構(gòu)建表達(dá)了具有較強(qiáng)的HBSAG結(jié)合活性和特異性的抗HBSAG單克隆抗體HB192，且HB192擁有極好地中和HBV的活性。結(jié)論我們成功構(gòu)建和表達(dá)了具有很強(qiáng)的結(jié)合活性和生物學(xué)功能的抗HBV中和性單克隆HB192。

簡(jiǎn)介：中圈料孽教求犬論文題目作者姓名學(xué)科專業(yè)導(dǎo)師姓名完成時(shí)間OFSCIENCEANDTECHNOLOGYOFC蓖藏毒素A鏈和壇糖體蛋白P2相互作月的研憲及金黃色葡萄球菌中ROL和SAER”’的結(jié)均生物學(xué)鏟競(jìng)二_一七年五月■譬一叟燹翁鼙一1O√，Ⅶ攀P‘～KR?！劭贠RT_T●J1●●UNIVERSITYOFSCIENCEANDTECHNOLOGYOFCHINAA，DISSERTATIONFORDOCTOR’SDEGREESTRUCTUREBASESOFR偽INTERACTIONWITHP2ANDROTANDSAERDBDINSTAPHYLOCOCCUSAUREUSAUTHOR’SNAMEXIAOJIAOFANSPECIALITYSTRUCTURALBIOLOGYSUPERVISORSPROFMAIKUNTENGPROFLIWENNIUFINISHEDTIMEMAY2017