胰高血糖素通過DAG-PKC信號(hào)通路對(duì)胰島β細(xì)胞胰島素分泌的影響.pdf

1、目的：通過探討不同濃度的胰高血糖素（Glucagon，GC）及不同濃度葡萄糖(Glucose，Glu)刺激對(duì)胰島β細(xì)胞系MIN6細(xì)胞中胰島素（insulin，Ins）分泌的影響及對(duì)二脂酰甘油（Diacylglycerol,DAG）、蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）表達(dá)的影響，進(jìn)一步明確GC對(duì)胰島素分泌的作用及機(jī)制。
　　方法：1.對(duì)小鼠胰島瘤細(xì)胞株MIN6細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，生長(zhǎng)到一定細(xì)胞密度之后進(jìn)行傳代及分組

2、，在不同Glu濃度即無糖（0mmol/L）、低糖（2.8mmol/L）及高糖（16.7mmol/L）和不同GC濃度即無GC（0ng/L）、低濃度GC（100ng/L）、中濃度GC（500ng/L）及高濃度 GC（1000ng/L）的刺激作用下收集細(xì)胞培養(yǎng)皿中的上清液，采用酶聯(lián)免疫吸附法（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）檢測(cè)DAG濃度的水平；2.將敏感的熒光生物傳感器 CKAR（PKC表達(dá)的

3、質(zhì)粒）及陰性對(duì)照空質(zhì)粒 PCDNA3.1采用真核細(xì)胞電穿孔的方法轉(zhuǎn)染入MIN6細(xì)胞中，在不同Glu及不同GC濃度刺激因素下采用基于熒光生物傳感器的熒光能量共振轉(zhuǎn)移（Fluorescence resonance energy transfer，F(xiàn)RET）的技術(shù)觀察細(xì)胞熒光的變化從而實(shí)時(shí)測(cè)定細(xì)胞內(nèi)PKC含量的表達(dá)；3.采用ELISA法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)胰島素分泌的水平。
　　結(jié)果:1.ELISA法檢測(cè)不同濃度Glu及不同濃度GC刺激下MIN6

4、細(xì)胞上清液中DAG含量的結(jié)果如下：（1）在低糖和高糖濃度條件下，隨著 GC濃度的升高，DAG含量也隨之升高，趨勢(shì)明顯，且高糖濃度下，DA G增加趨勢(shì)較低糖濃度下增加趨勢(shì)更加明顯；在無糖濃度條件下高濃度GC刺激下DAG濃度沒有隨GC濃度升高而升高的趨勢(shì)。（2）不同GC濃度組間進(jìn)行比較：無糖條件下，中GC組DAG水平高于無GC組（P<0.05）；低糖條件下：高、中、低GC組DAG水平均高于無 GC組（P<0.05），高GC高于低GC組（P<

5、0.001），高GC組DAG水平高于中GC組（P<0.001）；高糖環(huán)境下：高、中 GC組 DAG水平均高于無 GC組（P<0.001），高 GC組 DAG水平高于低 GC組（P<0.001），高GC組DAG水平高于中GC組（P<0.05）。2.基于熒光生物傳感器的FRET技術(shù)檢測(cè)MIN6細(xì)胞內(nèi)PKC含量的變化：轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒：加入1000ng/LGC+16.7Glu處理組后與空白對(duì)照組kreb液相比CFP/YFP比值無明顯差異P>0.05

6、；轉(zhuǎn)染PKC質(zhì)粒CKAR后：（1）無糖時(shí)，在低濃度GC及中濃度GC刺激下，CFP/YFP比值曲線上升，曲線上升趨勢(shì)平緩，且中濃度GC刺激下較低濃度GC刺激下CPP/YFP比值差異明顯（P<0.05）；高濃度GC刺激后，CFP/YFP曲線沒有上升的趨勢(shì)。（2）在低糖條件下，給予低濃度及中濃度GC處理CFP/YFP比值曲線上升，上升趨勢(shì)平緩，且中濃度GC刺激較低濃度刺激時(shí)相比CFP/YFP比值差異明顯（P<0.05）；給予高濃度GC刺激后，

7、CFP/YFP曲線繼續(xù)上升，上升趨勢(shì)較明顯，較低濃度GC及中濃度GC刺激階段相比比值升高（ P<0.05）。（3）在高糖條件下，給予低濃度及中濃度GC處理CFP/YFP比值曲線上升，上升趨勢(shì)平緩，給予高濃度 GC刺激后，CFP/YFP曲線繼續(xù)上升，上升趨勢(shì)較明顯，較低濃度GC及中濃度GC刺激階段相比比值升高（P<0.05）。3. ELIS A法檢測(cè)不用濃度GC及不同濃度Glu刺激下MIN6細(xì)胞上清液中胰島素含量的結(jié)果如下：(1)在無糖，

8、低糖，高糖濃度下，隨著GC濃度的增加，MIN6細(xì)胞胰島素分泌量也隨之增加，且隨著葡萄糖濃度由低到高，胰島素分泌量增加趨勢(shì)越明顯，在高糖濃度下，胰島素濃度增加趨勢(shì)最大。(2)不同GC濃度組間進(jìn)行比較：無糖條件下，高、中、低GC組胰島素濃度均高于無GC組（P<0.01），高GC組胰島素濃度高于低中GC組（P<0.01）；低糖條件下，高GC和中GC組胰島素濃度均高于無GC組（P<0.01），高GC組高于低GC組（P<0.01）；高糖條件下，高