蠟梅水通道蛋白CpAQPl轉(zhuǎn)錄水平變化及其啟動(dòng)子活性分析.pdf

1、張迷(2009)等人在已構(gòu)建的蠟梅花cDNA文庫及EST分析的基礎(chǔ)上得到了2個(gè)蠟梅水通道蛋白基因CpAQP1和CpAQP2。通過構(gòu)建植物表達(dá)載體,利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤法轉(zhuǎn)化煙草,對轉(zhuǎn)基因煙草進(jìn)行干旱、高鹽、高溫處理,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因煙草的耐受性比非轉(zhuǎn)基因煙草有顯著提高,初步證明蠟梅水通道蛋白與植物抗逆性有關(guān)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證和探索該基因的功能,可以通過研究該基因轉(zhuǎn)錄水平變化和分析啟動(dòng)子調(diào)控區(qū)域說明CpAQP1在抗逆性及其他生理功能中可能起到

2、的作用。因此,本研究在張迷等人的基礎(chǔ)上,利用熒光定量PCR技術(shù)對蠟梅花發(fā)育的各個(gè)花期、各個(gè)組織和不同脅迫下的水通道蛋白CpAQP1的表達(dá)量進(jìn)行分析,并利用hi-TAILPCR技術(shù)克隆蠟梅水通道蛋白基因CpAQP1基因啟動(dòng)子區(qū)域1082bp,利用生物信息學(xué)軟件對其進(jìn)行分析,并構(gòu)建植物表達(dá)載體,通過根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤法轉(zhuǎn)化模式植物煙草,研究該啟動(dòng)子活性。本文主要研究結(jié)果如下:
　　 1、CpAQP1基因的表達(dá)分析
　　 實(shí)

3、時(shí)熒光定量PCR分析表明:CpAQP1在蠟梅不同組織中的表達(dá)量不同,盛開期花瓣中的表達(dá)量最高,該基因的表達(dá)可能具有發(fā)育階段特異性;在高溫、低溫、高鹽、ABAA和重金屬不同非生物脅迫處理下,CPAQP1的表達(dá)量變化趨勢也存在差異.結(jié)果說明CPAQP1可能在蠟梅的生長發(fā)育、細(xì)胞衰老和非生物脅迫應(yīng)答的過程中發(fā)揮作用.
　　 2、CpQP1啟動(dòng)子的克隆
　　 在CpQP1基因ORF的5'端設(shè)計(jì)三條巢式引物,利用Liu等人改良的T

4、AIL-PCR:hiTAIL-PCR法擴(kuò)增到蠟梅水通道蛋白基因CpQP1的5'啟動(dòng)子1082bp,命名為CpQP1pro(GenBank登錄號:JQ952563)。
　　 3、CpAQP1pro啟動(dòng)子序列分析
　　 用PlantCare軟件對CpAQP1pro進(jìn)行分析,該啟動(dòng)子除了具有TATA-box和CAAT-box等基本轉(zhuǎn)錄元件外,還有光應(yīng)答元件、茉莉酸甲酯應(yīng)答順式調(diào)控元件、水楊酸應(yīng)答元件、脅迫相關(guān)應(yīng)答元件、胚乳表達(dá)

5、必須的順式作用元件。
　　 4、植物表達(dá)載體構(gòu)建
　　 通過酶切和連接將該啟動(dòng)子代替植物表達(dá)載體PBI121中的35s啟動(dòng)子與GUS報(bào)告基因相連,通過PCR和雙酶切驗(yàn)證結(jié)果,說明已成功構(gòu)建植物表達(dá)載體PBI121-CpAQP1pro。
　　 5、煙草轉(zhuǎn)化及活性分析
　　 利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤法將轉(zhuǎn)入表達(dá)載體的PBI121-CPAQP1pro轉(zhuǎn)入野生型煙草,通過對轉(zhuǎn)基因煙草葉片GUS組織化學(xué)染色,結(jié)果說