抑制Dicer的表達對哺乳動物細胞中CpG島甲基化的影響.pdf

1、Dicer是siRNA生物合成過程中的關鍵酶。研究表明Dicer能夠在很多物種中調(diào)節(jié)異染色質(zhì)的形成，影響DNA甲基化和組蛋白修飾，但是，哺乳動物細胞中Dicer是否具有類似的功能，目前尚不十分清楚。
　　目的：
　　本文旨在研究Dicer對哺乳動物細胞中基因啟動子的CpG島DNA甲基化的調(diào)節(jié)及相應蛋白編碼基因表達的影響，并初步探討在Dicer低表達的細胞中，基因啟動子的CpG島DNA甲基化的水平與基因表達水平的相關性。

2、>　　方法：
　　1.用人結腸癌細胞HCT116構建Dicer低表達穩(wěn)定細胞系，通過RT-PCR及westernblot鑒定陽性克隆。
　　2.在HCT116細胞中瞬時轉染Dicer siRNA抑制Dicer的表達，用RT-PCR及western blot檢測轉染效果。
　　3.在穩(wěn)轉及瞬轉細胞中用實時定量RT-PCR檢測基因的表達水平。用Bisulfitesequencing技術檢測細胞中基因啟動子CpG島的甲基化水

3、平。
　　結果：
　　1.成功構建了Dicer低表達的HCT116穩(wěn)定細胞系。
　　2.在抑制Dicer表達的穩(wěn)定細胞系中，CPEB2、ICAM-1、LHFP、LIPG、PELI2、SERTAD4、RTN1、SFRP4的mRNA水平增加，LHFP和ICAM-1的CpG島的DNA甲基化水平降低。
　　3.在瞬時轉染Dicer siRNA的HCT116細胞中，抑制Dicer的表達能夠誘導CPEB2、PELI2、RTN