肉毒毒素重組基因工程疫苗研究.pdf

1、肉毒毒素又被稱為肉毒神經(jīng)毒素，是由厭氧的革蘭氏陽性菌肉毒梭菌產(chǎn)生的外毒素，是已知毒性最強(qiáng)的蛋白，根據(jù)其抗原性不同可以分為7種類型（BoNT/A-BoNT/G），A、B、E和F型可以導(dǎo)致人類中毒，其中A型肉毒毒素中毒致死率最高。各型肉毒毒素分子結(jié)構(gòu)比較相似，分子量大小約150 kDa，由二硫鍵連接一個(gè)100 kDa的重鏈（HC）和一個(gè)50 kDa的輕鏈（LC）組成。肉毒毒素重鏈羧基端（HC）負(fù)責(zé)與細(xì)胞受體的結(jié)合，重鏈氨基端（HN）介導(dǎo)L鏈

2、的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)；輕鏈具有鋅離子內(nèi)肽酶活性，能夠?qū)⒖扇苄訬-乙基馬來酰亞胺敏感因子附著蛋白受體（SNARE）切割而抑制神經(jīng)遞質(zhì)的傳遞，最終會(huì)導(dǎo)致骨骼肌麻痹，呼吸衰竭而死亡。
　　肉毒毒素生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單，穩(wěn)定性良好，具有極強(qiáng)的致死性，是一種潛在的生物武器，極容易被制備成生物戰(zhàn)劑應(yīng)用。此外，近些年來由于肉毒毒素導(dǎo)致的中毒事件也時(shí)有發(fā)生，因此，對(duì)于預(yù)防和治療肉毒毒素中毒的研究具有十分重要的意義。接種疫苗是一種有效預(yù)防肉毒毒素中毒的策略。鑒于早期

3、研制的類毒素疫苗存在較多的缺陷，所以一直未能得到十分廣泛的應(yīng)用，因此研究新型肉毒毒素疫苗成為一種迫切的需要。破傷風(fēng)毒素（TeNT）和肉毒毒素在結(jié)構(gòu)上有較多的相似之處，所以借助于破傷風(fēng)毒素 Hc片段亞單位疫苗研究成功的策略來研制肉毒毒素亞單位疫苗。肉毒毒素受體結(jié)合區(qū) Hc能介導(dǎo)毒素特異性結(jié)合到神經(jīng)肌肉接點(diǎn)處的神經(jīng)末梢，此外，Hc片段不存在鋅肽鏈內(nèi)切酶活性，沒有毒性，免疫動(dòng)物后能刺激產(chǎn)生保護(hù)性免疫反應(yīng)?；谶@一重要發(fā)現(xiàn)，研究人員開始以肉毒毒

4、素受體結(jié)合區(qū) Hc為靶標(biāo)，開展新型肉毒毒素重組亞單位疫苗和核酸疫苗的研究。
　　DNA疫苗是將編碼抗原的基因克隆到真核表達(dá)載體中作為疫苗，免疫動(dòng)物后該載體會(huì)在體內(nèi)表達(dá)抗原，繼而刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)和保護(hù)作用。DNA疫苗具有很多優(yōu)點(diǎn)：生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單、產(chǎn)品易純化、便于儲(chǔ)存，在接種者體內(nèi)表達(dá)抗原，并且能夠產(chǎn)生體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)，然而，DNA免疫原性較低，不足以提供足夠的保護(hù)作用，距離真正的人類臨床應(yīng)用還有一定的差距，需要進(jìn)一步提高與放

5、大祼DNA的免疫效果。樹突狀細(xì)胞（DCs）是體內(nèi)已知最強(qiáng)的專職抗原遞呈細(xì)胞，在抗原遞呈和啟動(dòng)機(jī)體免疫應(yīng)答中具有十分重要的作用。DEC205是表達(dá)于樹突狀細(xì)胞表面的內(nèi)吞性受體，能夠高效地介導(dǎo)抗原的攝取、加工處理以及遞呈。為了增強(qiáng)肉毒毒素 DNA疫苗的免疫原性，本研究開展了A型肉毒毒素受體結(jié)合區(qū)Hc抗原靶向DCs的DNA疫苗研究工作。將編碼抗DEC205的抗體基因（scDEC）和編碼 A型肉毒毒素受體結(jié)合區(qū)基因（AHc）融合，并克隆到真核表

6、達(dá)載體pVAX1中，構(gòu)建了一個(gè)DCs靶向的DNA疫苗（pVAX1-scDEC-AHc）,同時(shí)還設(shè)置了非靶向的疫苗載體（pVAX1-SAHc）和陰性對(duì)照（pVAX1）。免疫小鼠后證明該DCs靶向的DNA疫苗確實(shí)能夠增強(qiáng)抗原特異性體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)；相比于非靶向 DNA疫苗，其抗體滴度增強(qiáng)了2.5倍，細(xì)胞免疫反應(yīng)也有較大程度的增強(qiáng)?？贵w亞型測(cè)定的結(jié)果表明該DNA疫苗免疫小鼠后產(chǎn)生了以IgG1為主的抗體，即免疫反應(yīng)以Th2型免疫應(yīng)答途徑為主。

7、保護(hù)性試驗(yàn)結(jié)果證明pVAX1-scDEC-AHc疫苗免疫后能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)的保護(hù)性免疫反應(yīng)，30μg劑量免疫兩次之后即能對(duì)103 LD50的A型肉毒毒素產(chǎn)生完全保護(hù)作用，而pVAX1-SAHc疫苗僅為12.5％的保護(hù)效率；三次免疫之后對(duì)104 LD50的A型肉毒毒素具有87.5%的保護(hù)效率，pVAX1-SAHc疫苗僅為12.5%的保護(hù)效率，這些結(jié)果表明 pVAX1-scDEC-AHc DNA疫苗相對(duì)于pVAX1-SAHc疫苗具有更高的

8、保護(hù)效率。通過脾細(xì)胞流式分析和免疫注射部位肌肉組織免疫組化實(shí)驗(yàn)研究了該 DNA疫苗的 DCs靶向效應(yīng)，結(jié)果表明pVAX1-scDEC-AHc疫苗免疫后能夠在免疫注射部位募集更多的DCs，促進(jìn)其成熟，并且能夠高效地促進(jìn)免疫器官中的DCs進(jìn)行增殖和成熟，這些結(jié)果提示該DNA疫苗能夠增強(qiáng)免疫反應(yīng)可能要?dú)w功于這種DCs靶向作用。
　　本研究工作還對(duì)原核表達(dá)的可溶性B型肉毒毒素重組亞單位疫苗的免疫原性進(jìn)行了研究。本實(shí)驗(yàn)將B型肉毒毒素受體結(jié)合

9、區(qū)Hc段基因克隆到pTIG-Trx原核表達(dá)載體，利用大腸桿菌BL21(DE3)菌株實(shí)現(xiàn)了BHc的可溶性表達(dá)，破菌上清用HisTrapTM HP蛋白純化柱和CaptoTM MMC層析柱進(jìn)行純化，純化到了純度較高的帶His標(biāo)簽的和無His標(biāo)簽的BHc抗原。免疫小鼠研究該大腸桿菌表達(dá)的重組BHc的免疫原性和保護(hù)效果，結(jié)果表明1μg該重組BHc單劑量免疫小鼠就能對(duì)103 LD50的B型肉毒毒素產(chǎn)生完全保護(hù)作用，兩次免疫則可以對(duì)104 LD50的

10、B型肉毒毒素產(chǎn)生完全保護(hù)作用。測(cè)定BHc-His免疫的小鼠血清中特異性抗體滴度平均可以達(dá)到1:110000，血清中和效價(jià)可以達(dá)到3.33 IU/ml；BHc免疫的小鼠血清中特異性抗體滴度平均可以達(dá)到1:70000，血清中和效價(jià)可以達(dá)到2.33 IU/ml；而酵母表達(dá)的mBHc免疫組僅為1:40000和1.25 IU/ml；這些結(jié)果表明大腸桿菌表達(dá)的重組BHc-His抗原具有良好的免疫原性和保護(hù)效果。此外，對(duì)于沒有His標(biāo)簽的BHc抗原的

11、免疫原性研究結(jié)果表明其同樣具有很好的保護(hù)效果，可以作為候選的B型肉毒毒素重組亞單位疫苗進(jìn)行下一步研究與開發(fā)。
　　總結(jié)以上研究結(jié)果，在A型肉毒毒素Hc靶向DCs的DNA疫苗研究中證明了通過DEC205受體將抗原靶向到DCs的策略確實(shí)能夠增強(qiáng)融合抗原免疫后的體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)，為增強(qiáng) DNA疫苗的免疫原性提供了一個(gè)新思路，并為其他型肉毒毒素或者其他病原體 DNA疫苗的研究提供了新的技術(shù)平臺(tái)。B型肉毒毒素重組亞單位疫苗的研究結(jié)果表明大