Exendin-4通過拮抗鈣超載改善Aβ31-35誘導的HT22海馬神經(jīng)細胞Per1異常表達.pdf

1、β-淀粉樣蛋白（amyloidβ-protein，Aβ）在腦內的異常積聚是阿爾茨海默?。ˋlzheimer's disease，AD）晝夜節(jié)律紊亂的病理基礎。研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)元對胞內鈣離子水平變化極度敏感，在過量沉積Aβ的雙轉基因小鼠腦區(qū)中研究發(fā)現(xiàn)Aβ積聚的區(qū)域鈣穩(wěn)態(tài)失衡。而神經(jīng)系統(tǒng)正常功能的發(fā)揮需要鈣離子信號的參與。研究發(fā)現(xiàn)，周期性的鈣離子內流是維持SCN節(jié)律性的重要原因?？梢娾}離子信號與晝夜節(jié)律的形成與維持密切相關。per1作為晝夜系

2、統(tǒng)輸出途徑的重要因子，在調控晝夜節(jié)律周期和維持晝夜節(jié)律穩(wěn)定中均發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，per1基因的表達受鈣離子水平變化的影響，但由Aβ引發(fā)的鈣超載對Per1表達變化的影響目前仍未有報道。本研究將在細胞水平來探討Aβ31-35引起的鈣超載對Per1表達變化的影響。
　　胰高血糖素樣肽-1（Glucagon-like peptide-1，GLP-1）長效類似物Exendin-4的神經(jīng)保護作用已有眾多研究報道，我們團隊前期研究發(fā)現(xiàn)Ex

3、endin-4在調節(jié)晝夜節(jié)律紊亂中具有重要作用，但可能的作用機制不清。本研究以海馬神經(jīng)細胞系HT22為實驗對象，檢測不同處理組per1 mRNA在各CT時間點的表達變化情況，并在差異最顯著的CT時間檢測了PER1蛋白的相對表達量及其原位表達情況以及胞內鈣離子水平變化來進一步探討Aβ31-35對Per1表達變化影響及Exendin-4發(fā)揮神經(jīng)保護作用的可能機制。
　　第一部分：Aβ31-35導致HT22海馬神經(jīng)細胞Per1異常表達<

4、br>　　目的：
　　觀察Aβ31-35對HT22細胞存活率、形態(tài)及Per1表達變化的影響。
　　方法：
　　將培養(yǎng)細胞隨機分為對照組和Aβ31-35組，以1％FBS饑餓1 h來誘導細胞同步化（CT0）；細胞同步化之后對照組用完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，而Aβ31-35組則更換為終濃度為25μM Aβ31-35繼續(xù)培養(yǎng)；MTT法檢測細胞存活率；熒光倒置顯微鏡下仔細觀察實驗細胞形態(tài)并進行拍照；Real-time PCR檢測不同C

5、T時間per1 mRNA表達情況，并在差異性最顯著的CT時間采用Western blot的方法檢測PER1蛋白相對表達量并用細胞免疫熒光染色的方法檢測了其原位表達情況。
　　結果：
　　經(jīng)25μM Aβ31-35作用24 h后細胞存活率為（63±2.34%）顯著低于對照組（100±0.66%）且鏡下可見Aβ31-35作用24 h后與對照組相比細胞數(shù)量較少，胞體皺縮，變圓細胞增多且細胞形態(tài)出現(xiàn)異常；Aβ31-35影響per1基

6、因節(jié)律性表達且在CT16時，Aβ31-35使per1 mRNA的表達（1.43±0.18）較對照組（0.65±0.11）異常升高（p<0.05）；進一步在該作用時間點檢測了PER1蛋白的表達情況，與對照組（1.0±0.07）相比，經(jīng)Aβ31-35處理后PER1蛋白相對表達量為（0.59±0.01）；同樣經(jīng)Aβ31-35處理后與對照組（100.31±0.35%）相比Aβ31-35使PER1蛋白的熒光強度明顯降低（51.76±2.52%，p

7、<0.05），差異具有統(tǒng)計學意義。
　　結論：
　　Aβ31-35使HT22細胞存活率降低，形態(tài)異常及Per1表達異常。
　　第二部分：Exendin-4改善Aβ31-35導致HT22海馬神經(jīng)細胞Per1異常表達
　　目的：
　　觀察Exendin-4預處理1 h后對Aβ31-35造成的細胞存活率下降、形態(tài)改變及Per1異常表達可能保護作用。
　　方法：
　　MTT法檢測細胞存活率；Real-t

8、ime PCR檢測Exendin-4預處理1 h后各CT時間per1 mRNA的表達情況，并在差異性最顯著的CT時間點采用Western blot的方法檢測Exendin-4預處理后PER1蛋白相對表達量并用細胞免疫熒光染色的方法檢測了其原位表達情況。
　　結果：
　　Exendin-4預處理1 h后能顯著提高 Aβ31-35導致的細胞存活率降低（77±2.68%）且鏡下觀察發(fā)現(xiàn)受損的細胞形態(tài)得到部分恢復；Exendin-4

9、預處理1 h后能部分改善per1基因的異常表達且在CT16時能明顯降低Aβ31-35導致的異常高表達per1基因水平（0.77±0.17，p<0.05）；經(jīng)Exendin-4預處理后與Aβ31-35組相比PER1蛋白的相對表達量明顯升高（0.80±0.03，P<0.05）；同樣其蛋白熒光強度值也顯著升高（81.18±4.98%，p<0.05），差異具有統(tǒng)計學意義。
　　結論：
　　Exendin-4能夠改善Aβ31-35導致

10、的HT22細胞存活率下降、形態(tài)異常及Per1異常表達。
　　第三部分：Exendin-4改善Aβ31-35誘導的HT22細胞Per1異常表達中的鈣離子調節(jié)機制
　　目的：
　　探討Aβ31-35導致Per1異常表達的可能作用機制及Exendin-4的保護作用。
　　方法：
　　Real-time PCR檢測Nimodipine預處理1 h后各CT時間per1基因的表達情況；在per1表達差異最顯著時間點，采

11、用流式細胞術及鈣離子熒光染色的方法檢測該時間點細胞內的鈣離子水平變化并用細胞熒光強度值的大小來反映。
　　結果：
　　Nimodipine預處理1 h后對Aβ31-35造成的per1異常表達起到同Exendin-4類似的作用效果，在CT16，Nimodipine能明顯降低Aβ31-35導致的異常高表達per1基因水平（0.89±0.07，p<0.05）；進一步檢測該時間點細胞的熒光強度，結果發(fā)現(xiàn)：Aβ31-35組細胞熒光強度

12、值為（584±31.35）較對照組（356±14.97）顯著增強；而經(jīng)Exendin-4預處理后能明顯降低Aβ31-35導致的異常增強的熒光強度（360±26.81），該結果與Nimodipine預處理后降低（446±13.89）異常增強的熒光強度具有同等的效果。
　　結論：
　　Exendin-4通過拮抗鈣超載改善Aβ31-35導致HT22海馬神經(jīng)細胞Per1異常表達。
　　承蒙國家自然科學基金“GLP-1對阿爾茨海