切應力在Caveolin-1介導腫瘤細胞粘附與遷移的力學生物學機制研究.pdf

1、目前，超過90％的癌癥患者死亡原因是由于腫瘤的轉(zhuǎn)移，腫瘤發(fā)生遠端轉(zhuǎn)移過程中，癌細胞會受到不同的機械力作用，如與其它細胞發(fā)生碰撞、血流產(chǎn)生的切應力。研究表明，切應力在調(diào)控腫瘤細胞的運動以及黏附過程中有著重要作用。Cav-1作為小窩結(jié)構(gòu)上重要的組成成分參與調(diào)控多種細胞功能，其中包括腫瘤的發(fā)生與轉(zhuǎn)移等。但是，在切應力條件下，Cav-1如何調(diào)控乳腺癌細胞粘附、骨架重構(gòu)、運動及其相關(guān)信號通路仍然不清楚。因此本研究主要探討Cav-1是如何介導切應力

2、引起的癌細胞骨架重排及黏附能力的變化及其生物力學機制。
　　在本研究中，選用高轉(zhuǎn)移性的乳腺癌MDA-MB-231細胞為研究對象。首先從形態(tài)學上觀察隨著切應力作用時間的增加，細胞面積更大，EF值更大。細胞在運動的過程中，許多蛋白和細胞器會傾向于位于細胞前端來幫助細胞定向運動，高爾基體是其中之一。免疫熒光標記GM130實驗表明，切應力作用1 h時，癌細胞極性無明顯變化，對比切應力作用2 h組與static2 h組，切應力組細胞極性明顯

3、增強。轉(zhuǎn)染EGFP-vinculin來標記黏著斑，對比切應力加載1 h組與FAK inhibitor組發(fā)現(xiàn)，切應力一定程度上促進黏著斑的形成。接著，臨床分析Cav-1與腫瘤惡性行為之間的關(guān)系，通過統(tǒng)計乳腺癌患者存活率發(fā)現(xiàn)高表達Cav-1的患者存活率較低。選取細胞系MCF-7，U-2OS，EMT6以及HeLa，通過劃痕實驗和Western blot實驗發(fā)現(xiàn) Cav-1的表達量與運動能力呈現(xiàn)正相關(guān)性。細胞骨架實驗結(jié)果表明，當沉默 Cav-1

4、后(shCav-1)，與對照組(shCtrl)相比，細胞生成應力纖維較少，當切應力處理后，shCtrl組和shCav-1組應力纖維都明顯增多。而用ROCK inhibitor(Y27632)處理MDA-MB-231細胞，骨架明顯破壞，再加載低切應力后，細胞骨架發(fā)生重排，應力纖維重新產(chǎn)生，并且切應力也會導致細胞突出增多，有利于細胞運動。隨后，通過延時攝影觀察細胞的運動，發(fā)現(xiàn)對shCtrl組和shCav-1組，切應力都能使得細胞形態(tài)快速變換

5、，因為細胞的運動伴隨著形態(tài)的變化，因此切應力促進細胞運動。觀察細胞運動軌跡，Cav-1高表達組細胞運動位移較大，運動速度較高。Western blot結(jié)果表明，在切應力的加載下，沉默Cav-1導致Filamin A表達上調(diào)，Cofilin及p-MLC表達下調(diào)，相應地，細胞運動能力較弱。再貼壁實驗結(jié)果表明，Cav-1的表達與剪切力都不利于癌細胞的再貼壁，在plastic，Collagen I，Matrigel上均有同樣的規(guī)律。進一步研究發(fā)

6、現(xiàn)，Cav-1的表達使得Src，p-Src，F(xiàn)AK，p-FAK表達均較高，有利于癌細胞的黏附與運動。光漂白實驗證實，沉默Cav-1后，黏著斑的運動速率較低，而細胞的運動需要黏著斑不斷地動態(tài)解聚與組裝，因此Cav-1的表達促進細胞的運動。最后，分別通過MTS實驗和流式細胞術(shù)實驗發(fā)現(xiàn)，Cav-1的表達不直接影響細胞增殖，凋亡以及周期，但是對于Cav-1高表達組，Src inhibitor和ROCK inhibitor能大幅降低癌細胞的存活率

7、。RT-PCR檢測integrin各亞型的mRNA表達，發(fā)現(xiàn)切應力的加載不會使得β1 integrin的mRNA表達改變，但是β1 inte grin會內(nèi)化進細胞膜內(nèi)與Cav-1共定位。免疫熒光標記active-β1 integrin，切應力的短時間加載使得整體活化的整合素增多，長時間又恢復至原水平。分析Z軸熒光強度發(fā)現(xiàn)，5 min時，膜表面的活化整合素明顯較多，10 min時活化整合素進入細胞質(zhì)。
　　研究表明，在切應力的處理下