八寶丹對原發(fā)性肝癌和脂肪肝的影響及機制研究.pdf

1、肝細胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)是中國乃至世界范圍內(nèi)惡性程度最高的腫瘤之一，在腫瘤死亡原因中排名前三位。近年來，HCC發(fā)病率和死亡率的上升對中國醫(yī)療衛(wèi)生事業(yè)提出了嚴峻的挑戰(zhàn)。10％-20％的HCC患者可以通過切除或移植手術(shù)進行治療，但復發(fā)率居高不下，而其他接受化療的患者，成功率非常低，總之總體生存率較低。在過去十年中，醫(yī)療及制藥行業(yè)雖然大力致力于遏制肝癌發(fā)病及進展的各種研究，但仍然沒有獲得有效的方法。

2、現(xiàn)今當務之急是降低或預防肝癌的發(fā)生，控制肝癌的進展。
　　炎癥貫穿于肝癌發(fā)生發(fā)展的過程中。乙型肝炎、丙型肝炎、酒精濫用所致的酒精性肝病、代謝綜合征、藥物肝損等都是造成肝臟慢性損傷的因素。肝臟慢性損傷進一步發(fā)展為慢性炎癥，在炎癥發(fā)展過程中，肝組織、肝細胞壞死，出現(xiàn)炎癥造就的惡劣環(huán)境，使正常肝細胞無法適應繼而死亡，而適應并存活下來的肝細胞則惡性轉(zhuǎn)化為肝癌細胞。惡性轉(zhuǎn)化的這部分細胞的來源是什么，又是什么因素促使它們進一步發(fā)展。
　

3、　肝前體細胞(hepatic progenitor cell，HPC)是肝臟內(nèi)具有自我更新、增殖及多項分化能力的細胞，參與肝臟損傷修復，在肝臟受到疾病影響出現(xiàn)慢性損傷時，HPC被激活（即膽管反應），增殖分化為適應性肝實質(zhì)細胞、膽管上皮細胞，參與修復。HPC與HCC的發(fā)生有緊密的關(guān)聯(lián)，HPC活化能促使HCC的發(fā)生，與早期腫瘤復發(fā)也有關(guān)。有證據(jù)證明HCC細胞具有HPC的特性，表達HPC標記物（如CK19）。另外，許多研究表明HPC是肝癌干細

4、胞(CSCs)的起源，因為它們是長壽命的細胞，有足夠長的時間累積DNA損傷，增加突變的風險。肝臟損傷、肝內(nèi)微環(huán)境改變、肝臟炎癥因子大量分泌情況下，影響肝前體細胞的增殖反應，導致其過程中信號通路失調(diào)，使HPC轉(zhuǎn)化為肝癌干細胞(CSCs)，導致肝癌發(fā)生。前期研究也發(fā)現(xiàn)脂多糖能抑制HPC的正常分化，通過NF-κB信號通路引起HPC腫瘤轉(zhuǎn)化，并且能促進肝前體細胞CD133的表達。因此，HPC細胞肝癌發(fā)生的起始細胞，其激活與炎癥微環(huán)境密切相關(guān)。<

5、br>　　巨噬細胞（肝內(nèi)Kupffer細胞）是人體內(nèi)最大最主要炎癥細胞，發(fā)揮重要的免疫作用，如清除損傷組織、細胞碎片及病原體等。研究認為巨噬細胞在肝癌的發(fā)展和炎癥之間起到紐帶作用。巨噬細胞具有一定的可塑性，在所處的微環(huán)境改變時，可極化為M1和M2兩種不同生物學功能的分型，其中M2型主要功能是參組織重塑以及Th2免疫反應，抗原提呈能力較弱，能促進肝癌細胞增殖、血管生成、ECM重塑，協(xié)助癌細胞逃逸并轉(zhuǎn)移。腫瘤相關(guān)巨噬細胞(tumor ass

6、ociatedmacrophage，TAM)與巨噬細胞M2表面分子及生物學功能相近，在肝癌微環(huán)境中起促進肝癌發(fā)展的作用。TAM在腫瘤內(nèi)的浸潤程度越深，患者預后就越差。此外也有研究表明T淋巴細胞和B淋巴細胞可間接通過巨噬細胞等作用于腫瘤細胞，進而促進腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。因此，巨噬細胞轉(zhuǎn)化為M2分形可以預示肝癌的發(fā)展。
　　Toll樣受體是機體重要的免疫應答感受器，該受體在免疫細胞和上皮細胞表面表達。TLR4是Toll樣受體(TLR)的

7、成員之一，HPC細胞能高表達TLR4，TLR4可以特異性應答細菌的LPS。此外，前期研究證明，TLR4能促進肝癌細胞的侵襲和遷移。因此，抑制TLR4的表達可能是抑制HCC發(fā)生和發(fā)展的策略之一。
　　肥胖是一個全球性的健康問題。非酒精性脂肪肝病始于肥胖引起的肝臟中甘油三酯的異常累積，過多的甘油三酯積累能引起脂肪變性。脂肪變性、肝細胞損傷、炎性浸潤和/或纖維化同時出現(xiàn)則被稱為非酒精性脂肪肝炎，在非酒精性脂肪肝病患者中，有四分之一的患者

8、會進展為非酒精性脂肪肝炎(NASH)。NASH又會進一步發(fā)展為肝硬化，最終發(fā)展為肝癌。對肥胖的早期控制和預防能降低非酒精性脂肪肝相關(guān)肝癌的發(fā)病率。
　　八寶丹是一種傳統(tǒng)中藥，含有牛黃，蛇膽，羚羊角，珍珠，麝香，三七等多種名貴天然成分，具有多重功效，廣泛應用于臨床各種肝膽疾病。八寶丹多組分在肝臟疾病治療中具有多功能、多環(huán)節(jié)、多靶點及多向調(diào)節(jié)的優(yōu)勢，可以針對肝癌及其他肝病復雜的微環(huán)境。前期研究表明，八寶丹可以抑制LPS誘導的TLR4的

9、表達，八寶丹可以通過調(diào)節(jié)炎癥微環(huán)境保護肝臟治療慢性肝病。
　　以往的研究都直接針對腫瘤本身進行的，設想是否可以通過對炎癥的抑制起到對腫瘤發(fā)生發(fā)展的抑制作用。因此，選擇八寶丹為抗炎藥物，調(diào)節(jié)改善肝臟炎癥微環(huán)境，觀察其對肝癌發(fā)生發(fā)展的抑制作用，并研究其可能的機制。
　　為了了解八寶丹對肝癌及脂肪肝的作用及可能的機制，本研究從以下三部分展開:第一部分八寶丹對肝癌發(fā)生的影響及機制;第二部分八寶丹對肝癌發(fā)展的影響及機制;第三部分八寶丹

10、對非酒精性脂肪肝的影響及機制。
　　第一部分:八寶丹對肝癌發(fā)生的影響及機制
　　本部分采用DEN誘導的大鼠和LPS誘導的WB-F344細胞為體內(nèi)外模型，在誘癌的同時，使用八寶丹進行干預，觀察了八寶丹對腫瘤發(fā)生的影響及可能的機制。
　　通過實驗發(fā)現(xiàn)，八寶丹能抑制DEN誘導的大鼠體內(nèi)腫瘤生長，抑制DEN引起的大鼠肝臟炎癥反應，改善肝功指標，減少肝臟炎性細胞浸潤和血清中炎癥因子的分泌。同時，八寶丹能抑制DEN誘導引起的肝臟組

11、織內(nèi)HPC細胞活化相關(guān)指標CK-19和SOX-9的表達，抑制膽管反應的發(fā)生。另外，通過體外細胞實驗，發(fā)現(xiàn)八寶丹可以抑制LPS誘導的WB-F344細胞克隆形成能力、成球能力和在裸鼠體內(nèi)的成瘤能力。通過進一步的機制研究發(fā)現(xiàn)，在大鼠體內(nèi)實驗和體外細胞實驗中，八寶丹能抑制DEN或LPS誘導引起的TLR4的表達增加，并且發(fā)現(xiàn)八寶丹能抑制LPS處理的WB-F344細胞中TLR4下游信號分子MyD88和TRAF6的表達增加。
　　本章研究結(jié)果提

12、示，八寶丹可以通過對TLR4及其下游信號分子MyD88和TRAF6的抑制，降低炎癥因子的表達，減少炎癥浸潤，改善肝臟微環(huán)境，減少肝前體細胞活化，從而抑制肝細胞惡性轉(zhuǎn)化降低HCC的發(fā)生率。
　　第二部分:八寶丹對肝癌發(fā)展的影響及機制
　　本部分，仍舊使用DEN誘導的大鼠及LPS誘導的WB-F344細胞為體內(nèi)外模型，但八寶丹的干預時間設定在腫瘤發(fā)生后，觀察了八寶丹對肝癌發(fā)展的影響及可能的機制。
　　使用DEN誘導大鼠形成腫

13、瘤后，再用八寶丹進行干預，腫瘤數(shù)量及大小均顯著下降，并且大鼠生存率也比未用八寶丹干預組顯著延長，通過肝組織HE染色發(fā)現(xiàn)八寶丹對腫瘤形成后的肝臟炎癥浸潤情況也能顯著控制?？梢姲藢毜ぞ哂幸种颇[瘤進展的作用。進一步考察肝臟組織內(nèi)巨噬細胞轉(zhuǎn)化情況，發(fā)現(xiàn)DEN能引起肝臟內(nèi)總巨噬細胞增多，這與其引起炎癥反應的結(jié)果是一致的，而在八寶丹干預后則使巨噬細胞總量下降。接著，觀察巨噬細胞分化情況發(fā)現(xiàn)，腫瘤組織內(nèi)部巨噬細胞M2的表達顯著增多，但用八寶丹干預后M

14、2表達量顯著下降。隨后使用體外分離的原代巨噬細胞驗證這一結(jié)果，發(fā)現(xiàn)LPS誘導巨噬細胞后，CD163的表達增多，說明巨噬細胞M2顯著增加;而LPS誘導后用八寶丹干預的細胞則CD163的表達下降，說明巨噬細胞M2顯著減少。進一步對可能的機制進行研究，發(fā)現(xiàn)DEN誘導的肝組織和LPS誘導的巨噬細胞中TLR4的表達顯著升高，并且LPS誘導的巨噬細胞中TLR4下游信號分子MyD88和TRAF6也顯著升高，而用八寶丹干預后，DEN誘導的肝臟組織或LP

15、S誘導的體外巨噬細胞中TLR4的表達量出現(xiàn)明顯下降，并且LPS誘導的巨噬細胞中TLR4下游信號分子MyD88和TRAF6也顯著下降。
　　以上結(jié)果提示八寶丹可能通過對TLR4及其下游信號分子MyD88和TRAF6的抑制從而減少巨噬細胞向M2分型的轉(zhuǎn)化，減少炎癥反應及炎癥因子分泌，抑制肝癌的進展。
　　第三部分:八寶丹對非酒精性脂肪肝的影響及機制
　　本部分采用高脂飲食小鼠建立肥胖小鼠模型，觀察八寶丹干預的情況下，對其脂

16、肪肝的影響及可能的機制。
　　發(fā)現(xiàn)八寶丹能降低高脂飲食引起的小鼠脂肪含量增加、脂肪體積增大及體重增加。八寶丹能改善高脂飲食引起的小鼠肝臟組織脂肪病變、總膽固醇(TC)和甘油三酯(TG)升高、血清高脂癥。在改善肝臟功能方面，發(fā)現(xiàn)八寶丹能降低高脂飲食引起的肝功能指標異常，改善肝臟和血清中炎癥因子的表達，改善肝臟纖維化情況，八寶丹能調(diào)節(jié)小鼠肝臟組織及血清中瘦素水平，使之恢復正常。進一步機制研究發(fā)現(xiàn)，抑制脂質(zhì)合成基因(ACC，SCD-1，

17、CD36，SREBP1-c，LXRα)的表達、激活促進脂肪酸氧化基因AMPK和p-AMPK的表達。
　　研究結(jié)果提示，八寶丹可能可以通過調(diào)節(jié)脂質(zhì)相關(guān)合成基因及脂肪酸氧化基因的表達抑制高脂飲食引起的脂肪肝及系列癥狀，如脂肪累積、體重增加，肝臟炎癥及纖維化反應等。八寶丹能抑制非酒精性脂肪肝的發(fā)展，對脂肪肝相關(guān)肝癌的發(fā)病具有預防意義。
　　綜上究結(jié)果，得到以下結(jié)論:
　　1、八寶丹通過對TLR4及其下游信號分子MyD88和T

18、RAF6的抑制，降低炎癥因子的表達，減少炎癥浸潤，改善肝臟微環(huán)境，減少肝前體細胞活化，從而抑制肝細胞惡性轉(zhuǎn)化降低HCC的發(fā)生率。
　　2、八寶丹能通過對TLR4及其下游信號分子MyD88和TRAF6的抑制從而減少巨噬細胞向M2分型的轉(zhuǎn)化，減少炎癥反應及炎癥因子分泌，抑制肝癌進展。
　　3、八寶丹能通過調(diào)節(jié)脂質(zhì)相關(guān)合成基因及脂肪酸氧化基因的表達抑制高脂飲食引起的脂肪肝及系列癥狀，如脂肪累積、體重增加，肝臟炎癥及纖維化反應等，抑