運(yùn)用CRISPR-cas9基因編輯技術(shù)敲除Tshr基因構(gòu)建CH大鼠模型的研究.pdf

1、先天性甲狀腺功能減癥（Congenital Hypothyroidism CH）是一種新生兒常見的內(nèi)分泌代謝性疾病，臨床表現(xiàn)為患兒體格發(fā)育遲滯和智能發(fā)育嚴(yán)重障礙。正是因?yàn)槠涓甙l(fā)病率且可導(dǎo)致機(jī)體多個器官的發(fā)育遲滯，所以我們有必要進(jìn)一步深入研究CH影響器官正常發(fā)育的作用機(jī)制。由于倫理學(xué)問題，人類不可能在對CH患者做出診斷后不進(jìn)行治療而繼續(xù)進(jìn)行研究，所以在體研究只能依靠CH動物疾病模型。但因?yàn)槟壳笆澜缟先狈蚯贸腃H大鼠模型，所以研究者獲

2、取CH大鼠模型都是通過藥物誘導(dǎo)的，而這顯然無法真正模擬由于基因突變所造成的CH對大鼠機(jī)體發(fā)育的影響，所以通過敲除調(diào)控甲狀腺發(fā)育或者甲狀腺激素合成的相關(guān)基因以構(gòu)建CH大鼠模型成為了CH深入研究的必要前提。本項(xiàng)研究在世界上首次運(yùn)用CRISPR/cas9基因編輯技術(shù)通過敲除促甲狀腺激素受體（Tshr）基因成功構(gòu)建了CH大鼠疾病模型，為今后最終明確甲狀腺激素在器官發(fā)育過程中的作用機(jī)制以及CH的病理機(jī)制提供了研究基礎(chǔ)。
　　研究主要內(nèi)容：<

3、br>　　一、目的質(zhì)粒的構(gòu)建和RNA體外轉(zhuǎn)錄：
　　將pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9質(zhì)粒（addgene Plasmid＃42230）進(jìn)行目的基因的克隆，即通過酶切、連接和轉(zhuǎn)化擴(kuò)大培養(yǎng)等步驟獲取目的質(zhì)粒。目的質(zhì)粒構(gòu)建成功后轉(zhuǎn)染大鼠BRL細(xì)胞進(jìn)行敲除效率驗(yàn)證。選取效率高的目的質(zhì)粒進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄，分別獲得cas9RNA和sgRNA。
　　二、受精卵顯微注射及移植
　　對清潔級SD野生型雌鼠促

4、排卵獲取受精卵，運(yùn)用顯微注射平臺對受精卵注射cas9RNA和sgRNA混合物，再選取注射成功的優(yōu)質(zhì)受精卵移植回清潔級SD假孕雌鼠輸卵管內(nèi)，移植完成后待正常分娩。
　　三、F0代幼鼠基因型的鑒定及脫靶情況的分析
　　在F0代幼鼠出生后第21天取幼鼠鼠尾提取基因組DNA，進(jìn)行基因測序分析。測序結(jié)果出現(xiàn)套峰后，對PCR產(chǎn)物進(jìn)行載體亞克隆，分析基因敲除結(jié)果，選取5個可能存在的脫靶位點(diǎn)進(jìn)行基因測序分析。
　　四、F0代大鼠表型的