載核酸藥物納米復(fù)合物的構(gòu)建與評(píng)價(jià).pdf

1、目的：
　　近年來，基因治療的發(fā)展非常迅速。RNA干擾（RNA interference， RNAi）是基因治療中最重要的發(fā)現(xiàn)之一，在治療腫瘤和病毒感染方面具有很大的使用潛力，得到了人們的廣泛關(guān)注。但是RNAi本身的一些理化性質(zhì)限制了小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）的應(yīng)用，穩(wěn)定性較差，易被生物體內(nèi)的核酸酶降解，降低了 siRNA的應(yīng)用效率；并且siRNA分子量較大，具有親水性和負(fù)電性，這些都影

2、響了 siRNA的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)效果。因此，如何能夠?qū)?siRNA成功地轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞質(zhì)中并發(fā)揮治療效果成為人們研究的熱點(diǎn)。
　　在siRNA的應(yīng)用研究中，一個(gè)重要的目的就是能夠使siRNA成功穿透細(xì)胞膜，進(jìn)入到細(xì)胞質(zhì)中發(fā)揮療效。因此，細(xì)胞穿膜肽（cell-penetrating peptides，CPPs）引起了人們的關(guān)注。細(xì)胞穿膜肽是由5-30個(gè)氨基酸按照一定的順序組成的兩性或陽性的短肽鏈。它能夠高效地穿過細(xì)胞膜，且能夠介導(dǎo)其它生物大分

3、子（比如siRNA）進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)中，是目前研究較熱的藥物載體。
　　本研究選用了具有類似穿膜肽性質(zhì)的八聚組氨酸（H8），它是由8個(gè)組氨酸分子反應(yīng)生成的一種陽性短肽，為了提高 H8的穿膜效率，將 H8與疏水基團(tuán)（硬脂酸，SA）反應(yīng)，合成 SA-H8和 SA-H8-PEG2000兩種陽性載體，將合成的載體通過靜電作用與 siRNA結(jié)合，組成SA-H8-PEG2000/siRNA和SA-H8-PEG2000n/siRNA納米復(fù)合物。通過測(cè)

4、定納米復(fù)合物的電位、粒徑、凝膠阻滯能力考察 SA-H8-PEG2000/siRNA和SA-H8-PEG2000n/siRNA的理化性質(zhì)，篩選出了SA-H8-PEG2000/
　　siRNA和 SA-H8-PEG2000n/siRNA的最佳處方配比。以 MCF-7細(xì)胞和A549細(xì)胞為模型，考察載體與細(xì)胞之間的相互作用，評(píng)價(jià)細(xì)胞對(duì)載體藥物的攝取效率。
　　方法：
　　通過查閱文獻(xiàn)和試驗(yàn)探索，確定了SA-H8和SA-H8-P

5、EG2000兩種陽性載體材料的合成和純化方法。將SA和H8在室溫條件下攪拌反應(yīng)1 h，用純凈水進(jìn)行透析純化，直接凍干備用，即得目的產(chǎn)物SA-H8。將SA-H8與mPEG2000-Mal溶液混合，避光反應(yīng)48 h，用純凈水透析純化，即得產(chǎn)物SA-H8-PEG2000。
　　以制劑的粒徑、電位和瓊脂糖凝膠電泳行為為指標(biāo)，考察制劑的理化性質(zhì)，篩選出最佳處方配比。
　　選擇 MCF-7細(xì)胞和 A549細(xì)胞為細(xì)胞模型，以流式細(xì)胞分析的

6、方法測(cè)定細(xì)胞的熒光強(qiáng)度，通過熒光強(qiáng)度的強(qiáng)弱來判定細(xì)胞的攝取效率，以評(píng)價(jià)載體對(duì)siRNA的轉(zhuǎn)染效率的貢獻(xiàn)。
　　結(jié)果：
　　將合成的產(chǎn)物進(jìn)行質(zhì)譜分析，結(jié)果顯示合成得到 SA-H8和SA-H8-PEG2000兩種共軛物。
　　以 siRNA作為模型效應(yīng)分子，通過室溫渦旋孵育的方法得到SA-H8-PEG200020％/siRNA、SA-H8-PEG200050%/siRNA和SA-H8-PEG2000/siRNA納米復(fù)合物。

7、通過測(cè)定電位、粒徑以及凝膠阻滯試驗(yàn)得到了納米復(fù)合物的理化性質(zhì)。SA-H8-PEG200020%/siRNA處方粒徑在200nm-700nm之間，且隨著N/P比的增加而變大。從瓊脂糖凝膠電泳的結(jié)果可以分析得到，當(dāng)N/P比為80時(shí)，仍然能夠看到清晰的條帶，說明siRNA未被完全包載，SA-H8-PEG200020%對(duì)siRNA的包載能力較差。SA-H8-PEG2000的比例提高至50%之后， SA-H8-PEG200050%/siRNA處方

8、粒徑在350nm-450nm之間。N/P比為80時(shí)， siRNA被完全包載。SA-H8-PEG2000/siRNA處方粒徑在300nm-400nm之間，且粒度分布相對(duì)均勻，當(dāng)N/P比大于或等于40時(shí)，實(shí)現(xiàn)siRNA的完全包載。綜上所述，選擇SA-H8-PEG200050%/siRNA80:1和SA-H8-PEG2000/siRNA80:1作為最終處方。
　　由流式細(xì)胞分析的結(jié)果可知：在 A549與 MCF-7細(xì)胞中， SA-H8-

9、PEG200050%/siRNA和 SA-H8-PEG2000/siRNA的細(xì)胞攝取率都隨著時(shí)間的推移而增大，呈現(xiàn)明顯的時(shí)間依賴性。SA-H8-PEG200050%/siRNA和 SA-H8-PEG2000/siRNA兩種載體形式的細(xì)胞攝取率明顯高于游離siRNA，但與市售制劑仍存在一定差距。
　　結(jié)論：
　　本研究所構(gòu)建的載體可以有效包載 siRNA并顯著提高其細(xì)胞攝取水平。然而，為達(dá)到市售制劑的轉(zhuǎn)染能力，仍有必要對(duì)載體的