黃羽扇豆懷特酮對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞的防癌抗癌作用機(jī)制研究.pdf

1、黃羽扇豆懷特酮(以下簡稱Lup)是一種具抗腫瘤活性的天然產(chǎn)物，屬于異黃酮類化合物。目前經(jīng)研究證實(shí)了異黃酮類物質(zhì)具有抗癌抗氧化方面的活性。但關(guān)于 Lup的藥理效應(yīng)和活性機(jī)制很少報(bào)道。本論文對(duì)本實(shí)驗(yàn)室合成Lup主要通過以細(xì)胞凋亡途徑探究抗癌機(jī)制和以Nrf2為靶點(diǎn)研究抗氧化、防癌機(jī)制。研究其是否為療效好，毒副作用低的防癌抗癌活性化合物。
　　PI3K/Akt途徑探究抗癌機(jī)制：利用MTT法檢測(cè)Lup對(duì)SH-SY5Y、Vero和HUVEC細(xì)

2、胞的毒活性，并研究Lup作用于SH-SY5Y細(xì)胞24、48和72小時(shí)后的增殖抑制率，結(jié)果表明，Lup表現(xiàn)出較高的細(xì)胞增殖抑制活性且呈現(xiàn)一定的時(shí)間和濃度依賴性。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)不同濃度的化合物L(fēng)up處理SH-SY5Y細(xì)胞，經(jīng)DAPI染色，利用流式細(xì)胞術(shù)(FCM)定量結(jié)果表明Lup能夠使SH-SY5Y細(xì)胞生長停留在G2/M期且Western blot印跡法檢測(cè)到相關(guān)周期蛋白Cyclin B1/D1和周期蛋白依賴性激酶CDK1/2/4/6的表

3、達(dá)也下調(diào)。Lup處理后的細(xì)胞經(jīng)AnnexinⅤ-FITC/PI熒光雙染后通過FCM分析凋亡情況，發(fā)現(xiàn)Lup可誘導(dǎo)發(fā)生凋亡。在顯微鏡下拍照分析經(jīng)Hoechst33258處理的形態(tài)變化，發(fā)現(xiàn)Lup處理的SH-SY5Y細(xì)胞染色質(zhì)皺縮，且出現(xiàn)凋亡的典型特征凋亡小體。同時(shí)western blot結(jié)果表明Lup可誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞的PI3K/Akt途徑中相關(guān)凋亡蛋白表達(dá)發(fā)生變化，Lup能使p-Akt、Bcl-2、procaspase9、PARP

4、-1的表達(dá)水平下降，上調(diào)Bax、cytochrome c、cleaved caspase-9、cleaved caspase-3、cleaved PARP-1蛋白的表達(dá)。此外，凋亡出現(xiàn)的時(shí)候常常會(huì)伴隨著線粒體膜電位(ΔΨm)崩潰及其內(nèi)部ROS的增加，F(xiàn)CM分析檢測(cè)到經(jīng)Rhodamine123染色Lup可以引起ΔΨm的缺失和利用DCFH-DA探針發(fā)現(xiàn)其能增加細(xì)胞內(nèi)ROS的生產(chǎn)。
　　Nrf2為靶點(diǎn)探究防癌機(jī)制：核轉(zhuǎn)錄因子Nrf2介導(dǎo)

5、的抗氧化信號(hào)通路在預(yù)防癌癥上是關(guān)鍵的靶向基因。利用Western blot檢測(cè)不同濃度的化合物L(fēng)up處理細(xì)胞后，SH-SY5Y細(xì)胞中的Nrf2與Keap1蛋白表達(dá)的變化，以及對(duì)細(xì)胞核中的Nrf2蛋白表達(dá)影響，發(fā)現(xiàn)Lup能使Keap1蛋白的表達(dá)降低，增加全細(xì)胞和核內(nèi)Nrf2蛋白的表達(dá)。通過免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Lup對(duì) Nrf2基因從胞漿到胞核遷移的作用，結(jié)果顯示隨著給藥濃度的增加Nrf2向核內(nèi)遷移的數(shù)量增多。隨后通過ARE-GFP報(bào)告因子檢測(cè)