FADS2基因在食管鱗狀細胞癌中的表達及其生物學功能的初步探究.pdf

1、研究背景和目的：
　　食管癌是人類常見的消化道惡性腫瘤之一，死亡率在所有腫瘤中排名第四[1]，病理類型分為鱗癌和腺癌，在我國食管鱗狀細胞癌（Esophageal squamous cell carcinoma,ESCC）是最主要的病理類型，其發(fā)病率具有明顯的地區(qū)差異和家族聚集現(xiàn)象，其高發(fā)區(qū)位于東亞以及中國東部地區(qū)，特別是河南的林州、安陽、輝縣和大別山區(qū)等地。當前的腫瘤分子生物學研究資料表明，環(huán)境、遺傳和精神心理等因素通過協(xié)同或序貫

2、的方式引起DNA損傷，使抑癌基因失活或者使原癌基因激活，加上凋亡調節(jié)基因或者DNA修復基因的異常改變，促使正常的食管粘膜經過一個多因素、多基因、多階段的惡性演化過程，由此發(fā)展為食管癌[2]，據(jù)此，從DNA修復基因、原癌基因、抑癌基因、代謝酶基因的遺傳多態(tài)性入手研究易感基因及腫瘤標志物可以為食管癌的早期診斷、治療及預后提供更多的理論依據(jù)[3]。有研究發(fā)現(xiàn)在乳腺癌組織中脂肪酸去飽和酶基因2(Fatty Acid Desaturase2,FA

3、DS2)表達水平增高，促進亞油酸（linoleic acid,LA）轉化成二十碳四烯酸（arachidonic acid,AA），同時其代謝產物前列腺素E2（Prostagland E2,PGE2)增多，在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展中起到一定的促進的作用[4]，在食管鱗癌中該基因表達水平顯著上調，其機制尚不清楚。本文通過相關實驗，檢測FADS2基因在ESCC及癌旁正常黏膜組織中mRNA及蛋白的表達情況，分析其與患者臨床病理特征和預后的關系；通過慢

4、病毒轉染系統(tǒng)構建穩(wěn)定表達FADS2的細胞克隆，進行體外細胞增殖實驗、軟瓊脂克隆形成實驗、平板克隆形成實驗、細胞遷移和侵襲實驗初步探討其生物學功能。
　　研究方法：
　　1.臨床標本的收集
　　從河南省林州市人民醫(yī)院收集手術切除的ESCC新鮮組織標本，每例標本包含食管鱗癌組織及癌旁組織，共70對，儲存于液氮中，用于提取組織RNA，檢測FADS2 mRNA的表達。另外，本課題組調取了河南省林州市人民醫(yī)院299例ESCC根治

5、切除術的石蠟包埋組織樣本，整理臨床病理和隨訪資料，制作ESCC的組織芯片。
　　2.方法
　　通過QPCR方法檢測FADS2 mRNA在70例ESCC及癌旁相對正常粘膜組織標本中的表達情況；通過免疫組織化學方法檢測FADS2蛋白在299對ESCC組織芯片中的表達水平，并分析FADS2的表達與ESCC患者臨床病理特征和預后的相關性。
　　通過慢病毒包裝系統(tǒng)將FADS2表達質粒分別轉染到食管癌細胞株KYSE30和KYSE5

6、10中，篩選出穩(wěn)定表達FADS2的細胞，并用QPCR、Western blot鑒定。
　　通過體外的細胞增殖實驗、平板克隆形成實驗、軟瓊脂克隆形成實驗、遷移實驗和侵襲實驗研究FADS2對細胞生長、克隆形成、遷移及侵襲能力的影響。
　　研究結果：
　　1.QPCR方法檢測FADS2在食ESCC及其相對應的癌旁正常粘膜組織中的表達，統(tǒng)計學結果顯示FADS2 mRNA在ESCC組織中呈現(xiàn)高表達現(xiàn)象，而在癌旁組織中呈現(xiàn)相對低表

7、達現(xiàn)象，且在 ESCC組織和癌旁組織中的表達水平差異具有統(tǒng)計學意義(p<0.05)。
　　2.IHC結果提示在有效的208例檢測樣本中，在癌組織中112例FADS2蛋白陽性表達(53.8％)，96例FADS2蛋白陰性表達(46.2%)；208例相對應的癌旁正常組織中，63例FADS2蛋白陽性表達(30.3%)，145例FADS2蛋白陰性表達(69.7%)，F(xiàn)ADS2的陽性表達率之間差異有統(tǒng)計學意義(p<0.05)。通過統(tǒng)計學分析，

8、發(fā)現(xiàn)FADS2高表達與患者淋巴結轉移和臨床分期有關（P<0.05），但與患者年齡、性別、腫瘤分化程度及浸潤均未發(fā)現(xiàn)有明顯相關性(P>0.05)。Kaplan-Meier分析結果表明，F(xiàn)ADS2高表達組（n=79）與正常表達組（n=129）的生存曲線有顯著差異，F(xiàn)ADS2高表達患者的中位生存時間18個月，F(xiàn)ADS2正常表達患者的中位生存時間27個月，二者差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
　　3.通過體外細胞功能實驗，我們發(fā)現(xiàn)過表達