NOD小鼠外周血CD4+NKG2D+IL17+T細胞功能初探.pdf

1、Ⅰ型糖尿病是一種自身反應性T細胞介導的自身免疫性疾病，主要機制為自身免疫性淋巴細胞浸潤胰島殺傷胰島β細胞，引起胰島素分泌絕對不足從而導致糖尿病。
　?、裥吞悄虿∫訡D4+T細胞和CD8+T細胞主導，同時有多種淋巴細胞如NK細胞，NKT細胞，γδT等細胞參與Ⅰ型糖尿病疾病進程。近年，國內(nèi)外研究均證實NKG2D表達不僅表達在NOD小鼠NK細胞表面，而且在其CD4+T細胞和CD8陽性T細胞表面表達，同時Th17細胞在NOD小鼠Ⅰ型糖尿病

2、中發(fā)揮重要的炎癥性作用。本課題利用流式細胞術(shù)動態(tài)檢測NOD小鼠CD4+T細胞的NKG2D、IL-17表達情況，以及其他細胞因子、核轉(zhuǎn)錄因子的表達，推測CD4+NKG2D+T細胞的功能和表型特征。
　　第一部分:NOD小鼠CD4+T細胞表達NKG2D與Ⅰ型糖尿病病程有關(guān)
　　目的:
　　動態(tài)監(jiān)測NOD小鼠體內(nèi)血糖變化，以及CD4+NKG2D+T細胞頻率，闡明CD4+NKG2D+T細胞與Ⅰ型糖尿病之間的關(guān)系。
　　方

3、法:
　　在NOD小鼠12周齡開始每周監(jiān)測外周血血糖變化情況。另外在8w，10w，12w，14w每隔2周流式細胞術(shù)檢測小鼠外周血CD4+NKG2D+T細胞的變化頻率。對血糖以及CD4+NKG2D+/CD4+的細胞頻率進行統(tǒng)計，分析NKG2D表達的CD4+T細胞與Ⅰ型糖尿病的相關(guān)性。
　　結(jié)果:
　　NOD小鼠血糖隨疾病進程逐漸增加，在28周齡達到最高。發(fā)病率統(tǒng)計結(jié)果顯示在12周齡開始有小鼠發(fā)病，在28周齡時比率達到最高

4、。流式細胞技術(shù)分析CD4+NKG2D+T細胞隨Ⅰ型糖尿病發(fā)展逐漸增加，在發(fā)病期細胞頻率達到最高。說明CD4+NKG2D+T細胞與NOD疾病進程有關(guān)。
　　第二部分:NKG2D+CD4+T細胞表型特征與功能分析
　　目的:
　　檢測CD4+NKG2D+T細胞膜分子表達和分泌細胞因子，推測CD4+NKG2D+T細胞的功能和表型特征。
　　方法:
　　隨小鼠疾病發(fā)展，按照15w，20w，25w，30w周齡通過流式

5、細胞術(shù)檢測CD4+NKG2D+T細胞膜分子表達和IL-17，INFγ，IL10等細胞因子表達情況進行檢測。
　　結(jié)果:
　　NOD小鼠疾病前驅(qū)期IL17分泌水平逐漸增高到發(fā)病期達到最高。IFNγ疾病前驅(qū)期和發(fā)病期分泌水平一直處于較高狀態(tài)。FasL，CD107a在疾病前驅(qū)期和疾病期低分泌或不分泌，推測CD4+NKG2D+T細胞沒有細胞毒活性。IL10分泌水平在整個病程過程中低分泌有可能沒有調(diào)節(jié)活性。CD25和CD69表面蛋白均

6、有表達，說明CD4+NKG2D+T細胞處在激活狀態(tài)。在疾病前驅(qū)期和疾病期隨病程中CD4+NKG2D+T細胞分泌IL17水平逐漸提高，推測與Th17細胞具有一定相似性。CD4+NKG2D+T細胞不具有細胞毒作用以及免疫調(diào)節(jié)作用。
　　第三部分:CD4+NKG2D+IL17+T細胞特征性分析
　　目的:
　　通過流式細胞術(shù)分析CD4+NKG2D+IL17+T細胞的特征，推測CD4+NKG2D+T細胞與Th17細胞之間的關(guān)系

7、。
　　方法:
　　按照小鼠疾病前驅(qū)期到30w以后疾病期，通過流式細胞術(shù)動態(tài)檢測小鼠外周血CD4+NKG2D+T細胞中轉(zhuǎn)錄因子RORγT，胞內(nèi)因子TGFβ，以及膜表面分子NK1.1，CCR6的表達水平，推測CD4+NKG2D+IL17+T細胞與Th17細胞之間的關(guān)系。
　　結(jié)果:
　　在疾病前驅(qū)期NOD小鼠外周血CD4+NKG2D+T細胞中RORγT表達逐漸提高，到發(fā)病期達到高峰，TGFβ水平較低，由于個體差異較

8、大，沒有統(tǒng)計學意義。疾病前驅(qū)期與疾病期相比CCR6分泌水平增高。CD4+NKG2D+T細胞表達NK1.1情況在發(fā)病期較發(fā)病前驅(qū)期有顯著增加，但是主要是CD4+NKG2D+NK1.1-胞為主。所以，CD4+NKG2D+T細胞是一群與Th17細胞功能相似的細胞。疾病前驅(qū)期和疾病期表達RORγT，但是促進Th17細胞分化的TGFβ低分泌，CD4+NKG2D+表面NK1.1主要為陰性，高表達CCR6，可以推測CD4+NKG2D+T細胞在Ⅰ型糖尿