結(jié)核分枝桿菌抗原定量檢測技術(shù)的建立及其初步評價(jià).pdf

1、結(jié)核病(TB)仍然是威脅全球人類健康一個(gè)重大的挑戰(zhàn)。在2012年估計(jì)有新增結(jié)核病例860萬，死于結(jié)核病有130萬人，其中有30萬人為HIV陽性。據(jù)估計(jì)，全球范圍內(nèi)的結(jié)核病發(fā)病率和與人類免疫缺陷病毒(HIV)共感染的病例數(shù)在未來數(shù)十年內(nèi)將大幅增加。在世界低收入國家的負(fù)擔(dān)較重，特別是在東南亞和撒哈拉以南的非洲。
　　在這些高負(fù)擔(dān)的地區(qū)，結(jié)核病診斷的基石仍然是痰涂片鏡檢。在HIV陰性的患者中，常規(guī)臨床檢測敏感性的變化在35％和80％之間

2、，但在艾滋病毒感染的患者中，敏感性低至20％。此外，在后一組中，痰稀缺性是常見的，這就需要增加操作過程，如誘導(dǎo)痰或支氣管鏡進(jìn)行樣品采集。傳統(tǒng)的痰涂片檢查在兒童和肺外結(jié)核的患者中的用處也有限。分枝桿菌培養(yǎng)需要幾個(gè)星期才能提供結(jié)果，價(jià)格昂貴且需要專門的實(shí)驗(yàn)室設(shè)施，在大多數(shù)高負(fù)擔(dān)地區(qū)仍無法使用。當(dāng)前，較新的T細(xì)胞定量檢測[γ-干擾素的釋放試驗(yàn)(IGRAs)]在高負(fù)擔(dān)的地區(qū)沒有實(shí)用性，同時(shí)不能區(qū)分潛伏的活動(dòng)性結(jié)核病。核酸擴(kuò)增試驗(yàn)(NAATs)有

3、限的特異性，使之在結(jié)核高負(fù)擔(dān)地區(qū)無法廣泛使用。結(jié)核病診斷仍然需要價(jià)格低廉，快速，易于推廣的檢測技術(shù)和產(chǎn)品。
　　迄今為止，大多數(shù)已開發(fā)的方法是基于特定循環(huán)抗體的檢測。在很長一段時(shí)間內(nèi)，肺結(jié)核的血清學(xué)診斷一直處于研究階段，但現(xiàn)在仍然沒有一個(gè)具有廣泛臨床應(yīng)用價(jià)值的檢測方法?？乖瓩z測幾乎可以肯定證實(shí)活動(dòng)性結(jié)核的存在。相比之下，抗體檢測并不能確定活動(dòng)性結(jié)核，甚至在清除感染半年后也能檢測到抗體反應(yīng)。我們應(yīng)該集中更多的力量在直接檢測體液中抗原

4、的基礎(chǔ)上來開發(fā)檢測方法。這樣的檢測方法對患者的診斷及治療過程中的隨訪可能是有用的。因?yàn)樵诩膊』钴S的階段，結(jié)核病具有高度的傳染性，對這種疾病快速，特異的檢測，不僅可以遏制結(jié)核病的蔓延，同時(shí)將幫助醫(yī)生開展恰當(dāng)、及時(shí)的治療，又可以減少多重耐藥(MDR)以及普遍耐藥(XDR)結(jié)核分枝桿菌菌株進(jìn)化的機(jī)會(huì)。
　　1983年，在腦脊液中第一次檢測到結(jié)核抗原，自此以后陸續(xù)有學(xué)者在痰液和腦脊液中通過ELISA、乳膠凝集法檢測到結(jié)核分枝桿菌抗原。近期

5、文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)則以ELISA和膠體金等檢測血清、CSF和尿中的PPD衍生物及其特定的菌體成份，如38kD抗原、MPT64、LAM等，其敏感性和特異性分別在20％～94.0％和78.6％～100％。但這些抗原都比較單一，而且大多數(shù)商業(yè)抗原檢測試劑盒不能滿足臨床的需要，因此這些結(jié)核分枝桿菌抗原的檢測方法未能廣泛應(yīng)用于診斷活動(dòng)性結(jié)核病。
　　本研究構(gòu)建了原核重組質(zhì)粒pBVIL1-38KD、pBVIL1-ESAT6、pBVIL1-CFP10，經(jīng)

6、溫度誘導(dǎo)在大腸桿菌中高效表達(dá)，用離子交換層析方法純化蛋白;融合蛋白IL1-38KD+ESAT6+ CFP10、GST-38KD+ESAT6+ CFP10經(jīng)溫度、IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后，用離子交換層析、親和層析方法純化蛋白。將純化得到的蛋白免疫動(dòng)物，獲得了高效價(jià)的單克隆及多克隆抗體。選用ProteinG親和層析法純化抗體，同時(shí)以純化得到的抗體分別作為包被抗體和檢測抗體建立雙抗體夾心檢測抗原ELISA法，在此基礎(chǔ)上建立了化學(xué)發(fā)光檢測結(jié)核分枝桿菌

7、抗原的定量檢測技術(shù)，并進(jìn)行初步臨床評價(jià)。
　　本研究共分五部分進(jìn)行:
　　1、以結(jié)核分枝桿菌H37Rv基因組DNA為模板，經(jīng)過PCR擴(kuò)增出結(jié)核分枝桿菌38KD，ESAT6，CFP10基因。通過分子克隆方法，成功構(gòu)建結(jié)核分枝桿菌38KD、ESAT6、CFP10基因的原核表達(dá)質(zhì)粒pBVIL1-38KD，pBVIL1-ESAT6，pBVIL1-CFP10。通過42℃水浴誘導(dǎo)質(zhì)粒pBVIL1-38KD，pBVIL1-ESAT6，pB

8、VIL1-CFP10在原核表達(dá)系統(tǒng)中有效表達(dá)出約53 kDa的IL1-38KD、21.3 kDa的IL1-ESAT6、21.1 kDa的IL1-CFPI0重組蛋白。通過離子交換層析法對IL1-38KD， IL1-ESAT6， IL1-CFP10重組蛋白進(jìn)行純化，經(jīng)間接EILSA法對純化的蛋白進(jìn)行了活性的初步鑒定，結(jié)果顯示克隆表達(dá)的蛋白具有很好的靈敏度和特異性。
　　2、本研究是基于實(shí)驗(yàn)室成功地構(gòu)建了pBVIL1-38KD+ESAT

9、6+ CFP10、PGEX-38KD+ESAT6+ CFP10質(zhì)粒的基礎(chǔ)上。誘導(dǎo)表達(dá)后采用離子交換層析及親和層析對融合蛋白進(jìn)行純化，獲得了高濃度、高純度的融合蛋白。對蛋白的活性進(jìn)行了鑒定，與各分片段蛋白相比，提高了檢測敏感性，并具有很好的特異性。
　　3、將純化的蛋白免疫大耳白兔，得到了兔抗結(jié)核分枝桿菌特異性抗原(38 KD、ESAT6、CFP10和融合抗原38KD+ESAT6+ CFP10)的多克隆抗體，效價(jià)分別為1∶32000

10、，1∶16000，1∶32000，1∶128000。將純化的蛋白免疫BALB/c小鼠，得到了鼠抗結(jié)核分枝桿菌特異性抗原的單克隆抗體，抗38kD的陽性克隆共4株:BBA171、BFE624、BBG411、BEA831，抗體滴度效價(jià)分別為1∶256000、1∶128000、1∶256000、1∶128000;抗ESAT6的陽性克隆1株:BFF1024，抗體滴度效價(jià)為1∶512000;抗CFP10的陽性克隆1株:BBG1028，抗體滴度效價(jià)為

11、1∶256000。
　　4、以單克隆、多克隆抗體為包被和標(biāo)記抗體，創(chuàng)建雙抗體夾心結(jié)核分枝桿菌抗原ELISA檢測法。對試劑各反應(yīng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，得到了結(jié)核分枝桿菌抗原檢測方法的最佳反應(yīng)條件:包被抗體與酶標(biāo)抗體分別為兔抗38KD+ESAT6+ CFP10多抗與HRP-兔抗38KD+ESAT6+ CFP10多抗;包被抗體濃度為0.25ug/ml;樣品與稀釋液按50ul+50ul稀釋;酶標(biāo)抗體濃度為1∶600。同時(shí)建立了抗原ELISA法的

12、標(biāo)準(zhǔn)曲線(y=0.0218x+0.1387，R2=0.9933)，確定了最低檢測限(1.11 ng/ml)。在結(jié)核分枝桿菌抗原ELISA方法的基礎(chǔ)上，建立了結(jié)核分枝桿菌抗原化學(xué)發(fā)光定量的檢測方法，標(biāo)準(zhǔn)曲線(y=15583x+89992，R2=0.9962)，確定了最低檢測限(0.46 ng/ml)。
　　5、對建立的結(jié)核抗原化學(xué)發(fā)光定量檢測技術(shù)進(jìn)行初步臨床評價(jià)，對接受抗結(jié)核治療的患者在不同時(shí)間段血清中抗原濃度的檢測，結(jié)果顯示患者血

13、清中的結(jié)核分枝桿菌特異性抗原會(huì)隨著治療時(shí)間而逐漸降低。經(jīng)過對結(jié)核患者痰結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)上清中結(jié)核特異性抗原的檢測結(jié)果，抗原化學(xué)發(fā)光技術(shù)與結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)陽性的符合率較高為92％，同時(shí)在結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)陰性的上清中，抗原的檢出率能達(dá)到27.11％。定量分析后結(jié)果顯示，在培養(yǎng)的這段時(shí)間內(nèi)結(jié)核分枝桿菌特異性抗原38KD、ESAT6、CFP10的分泌量主要集中在0.75ng/ml～40ng/ml之間。結(jié)核分枝桿菌特異性抗原化學(xué)發(fā)光檢測技術(shù)與商業(yè)