HepG2細(xì)胞對HCV core免疫應(yīng)答過程中ZIP8作用的初步研究.pdf

1、研究背景:
　　丙型肝炎病毒(HCV)感染被認(rèn)為是慢性肝炎的主要原因。慢性丙型肝炎患者首先發(fā)展為慢性炎癥，導(dǎo)致肝硬化（20-40％），隨后（4-6％的患者）發(fā)展成肝細(xì)胞癌（感染后的10-40年）。目前肝細(xì)胞癌的發(fā)病機(jī)制尚不明確，其與HCV相關(guān)性仍然存在爭議，研究表明HCV蛋白可加強(qiáng)致癌轉(zhuǎn)化。HCV-RNA基因編碼多聚蛋白前體，可經(jīng)病毒自身蛋白酶和宿主細(xì)胞作用后生成病毒體結(jié)構(gòu)蛋白（核心蛋白和糖蛋白E1和E2）和非結(jié)構(gòu)(NS)蛋白(p

2、7，NS2，NS3，NS4A，NS4B，NS5A和NS5B)。在體內(nèi)HCV核心蛋白(HCV core)可通過各種信號途徑來介導(dǎo)免疫反應(yīng)，促使炎癥的發(fā)生。
　　鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白通過調(diào)節(jié)鋅離子流入，流出和分布到細(xì)胞器中，來維持細(xì)胞內(nèi)的鋅穩(wěn)態(tài)，包括免疫系統(tǒng)的穩(wěn)態(tài)。鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白包括兩個蛋白家族:ZIPs(SLC39)和ZnTs(SLC30)。ZIPs轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白使細(xì)胞質(zhì)內(nèi)鋅離子含量升高，ZnTs轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白使細(xì)胞質(zhì)內(nèi)鋅離子含量降低，SLC39A8基因編碼

3、的ZIP8屬于ZIPs蛋白家族。Begum等人研究發(fā)現(xiàn)在人類免疫刺激的單核細(xì)胞和分化的巨噬細(xì)胞中，ZIP8轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白高水平表達(dá)。在ZIP8轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中，ZIP8主要定位于溶酶體上。研究顯示，鋅離子以ZIP8依賴的方式調(diào)節(jié)人體巨噬細(xì)胞中LPS介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，ZIP8敲除后會抑制在LPS驅(qū)動下的細(xì)胞內(nèi)鋅離子的積累，并使IL-10在mRNA水平上的表達(dá)升高。ZIP8通過調(diào)控Zn2+參與骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機(jī)制。此外，ZIP8可通過NF-κB信號途徑來

4、負(fù)反饋調(diào)節(jié)促炎反應(yīng)。
　　鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶（Calcineurin，CaN）屬于蛋白磷酸酶2B家族，依賴于Ca2+/鈣調(diào)素(CaM)調(diào)節(jié)，分布于許多哺乳動物器官。前期研究發(fā)現(xiàn)，在體外LPS刺激下CaN可以通過NF-κB信號途徑來調(diào)節(jié)炎癥因子的釋放，如:IL-2，NO。在CaN催化結(jié)構(gòu)域中，二價金屬離子如:Zn2+和Fe2+為必要元素，并且在體外可被Mn2+和Ni2+激活。
　　研究目的:
　　檢測正常人，丙肝患者和治愈后

5、丙肝患者外周血單個核細(xì)胞(PBMCs)中ZIP8 mRNA的表達(dá)情況，探討慢性丙型肝炎與ZIP8的關(guān)系。通過ZIP8過表達(dá)、RNA干擾和缺鋅、加鋅處理HepG2細(xì)胞來探討HepG2細(xì)胞對HCV core免疫應(yīng)答過程中ZIP8的作用。
　　實(shí)驗(yàn)方法:
　　1.臨床標(biāo)本
　　收集正常人(n=28)，丙型肝炎患者(n=39)，治愈后丙型肝炎患者(n=49)血液標(biāo)本，用qRT-PCR方法來檢測ZIP8 mRNA的表達(dá)。

6、　　2.HCV core對HepG2細(xì)胞ZIP8表達(dá)的影響
　　培養(yǎng)HepG2細(xì)胞，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染pcDNA3.1、pcDNA3.1-HCV core質(zhì)粒，24h后收集細(xì)胞，用qRT-PCR和Western blot方法檢測ZIP8在mRNA和蛋白水平上的表達(dá)。
　　3.ZIP8在HCV core免疫應(yīng)答過程中的作用
　　(1) ZIP8、HCV core表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，設(shè)為三組: Vector、HCVc和H

7、CVc+ZIP8，轉(zhuǎn)染24h后，收集細(xì)胞。
　　(2) ZIP8 RNA干擾轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，48h后，轉(zhuǎn)染HCV core表達(dá)質(zhì)粒，分為三組: Vector+NCsi、， HCVc+NCsi和HCVc+ZIP8si，繼續(xù)培養(yǎng)24h后，收集細(xì)胞。
　　4.ZIP8通過調(diào)控Zn2+在HCV core免疫應(yīng)答過程中的作用
　　(1)用2.5μM TPEN、50μM ZnCl2預(yù)處理HepG2細(xì)胞1h，然后轉(zhuǎn)染HCVcor

8、e表達(dá)載體，設(shè)為四組: Vector、 HCVc、HCVc+ ZrCl2和HCVc+TPEN，繼續(xù)培養(yǎng)24h后，收集細(xì)胞
　　(2) ZIP8 RNA干擾轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，48h后，用50μM ZnCl2預(yù)處理HepG2細(xì)胞1h，然后轉(zhuǎn)染HCV core表達(dá)載體，設(shè)為四組:Vector+NCsi、HCVc+NCsi、 HCVc+ZIP8si和HCVc+ZIP8si+ZnCl2，繼續(xù)培養(yǎng)24h后，收集細(xì)胞。
　　以上收集的細(xì)

9、胞用于提取RNA，細(xì)胞內(nèi)蛋白，胞內(nèi)核蛋白，進(jìn)一步用qRT-PCR檢測NF-κBp65、 IL-6、IL-8和TNF-α在mRNA水平上的表達(dá)。用Western blot檢測IKKβ、p-IKKβ以及核蛋白p-NF-κBp65在蛋白水平上的表達(dá)。
　　5.ZIP8和Zn2+對CaN活性的影響
　　提取各組細(xì)胞內(nèi)蛋白，用CaN試劑盒檢測各組CaN活性。
　　6.細(xì)胞內(nèi)鋅含量的測定
　　用鋅離子熒光探針來檢測HCVc、

10、HCVc+ZIP8、HCVc+ZnCl2、 HCVc+TPEN、HCVc+ZIP8si和HCVc+ZIP8si+ ZnCl2這六組實(shí)驗(yàn)組中細(xì)胞內(nèi)鋅離子含量。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　1.臨床標(biāo)本
　　與正常對照組相比，ZIP8 mRNA表達(dá)水平在丙型肝炎患者中顯著降低;在治愈后丙肝患者中無明顯差異。與丙肝患者相比，ZIP8 mRNA在治愈后的丙肝患者中表達(dá)顯著升高。
　　2.HCV core上調(diào)HepG2細(xì)胞ZIP8

11、的表達(dá)
　　與對照組相比，HCV core能夠顯著增加ZIP8在mRNA和蛋白水平上的表達(dá)。
　　3.ZIP8在HCV core免疫應(yīng)答過程中的作用
　　qRT-PCR結(jié)果顯示:ZIP8過表達(dá)能夠顯著降低NF-κBp65、IL-6、IL-8和TNF-α在mRNA水平上的表達(dá);ZIP8 RNA干擾能夠顯著升高NF-κBp65、IL-6、IL-8和TNF-α在mRNA水平上的表達(dá)。Western blot結(jié)果顯示:ZIP8

12、過表達(dá)能夠顯著降低IKKβ、p-IKKβ和核內(nèi)p-NF-κBp65在蛋白水平上的表達(dá)。ZIP8RNA干擾能夠顯著升高IKKβ、p-IKKβ和核內(nèi)p-NF-κBp65在蛋白水平上的表達(dá)。
　　4.ZIP8通過調(diào)控Zn2+在HCV core免疫應(yīng)答過程中的作用
　　qRT-PCR結(jié)果顯示:50μM ZnCl2加鋅處理能夠使NF-κBp65、IL-6、IL-8和TNF-α的mRNA表達(dá)水平顯著降低;2.5μM TPEN缺鋅處理能夠

13、使NF-κBp65、IL-6、IL-8和TNF-α的mRNA表達(dá)水平顯著升高;當(dāng)ZIP8被敲除后，50μMZnCl2加鋅處理同樣能夠使NF-κBp65、IL-6、IL-8和TNF-α的mRNA表達(dá)水平顯著降低。Western blot結(jié)果顯示:50μM ZnCl2加鋅處理能夠顯著降低IKKβ、p-IKKβ以及細(xì)胞核內(nèi)p-NF-κBp65在蛋白水平上的表達(dá);2.5μM TPEN缺鋅處理能夠顯著升高IKKβ、p-IKKβ以及細(xì)胞核內(nèi)p-NF

14、-κBp65在蛋白水平上的表達(dá);當(dāng)ZIP8被敲除后，50μM ZnCl2加鋅處理同樣能夠顯著降低IKKβ、p-IKKβ以及細(xì)胞核內(nèi)p-NF-κBp65在蛋白水平上的表達(dá)。
　　5.ZIP8和Zn2+對CaN活性的影響
　　ZIP8過表達(dá)能夠顯著抑制由HCV core誘導(dǎo)的CaN活性的升高;ZIP8 RNA干擾能夠顯著誘導(dǎo)CaN活性的升高;50μM ZnCl2加鋅處理能夠顯著抑制由HCVcore誘導(dǎo)的CaN活性的升高;2.5μ

15、M TPEN缺鋅處理能夠顯著誘導(dǎo)CaN活性的升高;當(dāng)ZIP8被敲除后，50μMZnCl2加鋅處理同樣能夠顯著抑制由HCV core誘導(dǎo)的CaN活性的升高。由此可見，ZIP8可通過調(diào)控Zn2+來抑制由HCV core誘導(dǎo)的CaN活性的升高。
　　6.細(xì)胞內(nèi)鋅含量的測定
　　HCVc+ZIP8和HCVc+ZnCl2對應(yīng)于對照組HCVc熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng);HCVc+ZIP8si和HCVc+TPEN對應(yīng)于對照組HCVc熒光強(qiáng)度明顯減弱

16、;HCVc+ZIP8si+ZnCl2對應(yīng)于對照組HCVc+ZIP8si熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)。
　　結(jié)論:
　　1.臨床標(biāo)本結(jié)果顯示:與正常對照組相比，ZIP8 mRNA表達(dá)水平在丙型肝炎患者中顯著降低;在治愈后丙肝患者中無明顯差異。推測ZIP8可能與HCV感染有一定的聯(lián)系。
　　2.體外實(shí)驗(yàn)顯示，ZIP8過表達(dá)和Zn2+可顯著抑制由HCV core誘導(dǎo)的炎癥因子表達(dá)的上調(diào)，NF-κB以及CaN活性的升高，而沉默表達(dá)ZIP8