TGF-β通過(guò)TAGLN2誘導(dǎo)食管鱗癌EC9706細(xì)胞遷移和浸潤(rùn).pdf

1、背景：中國(guó)食管癌（esophageal carcinoma, EC）居所有惡性腫瘤發(fā)病率和死亡率的第四位，每年新增EC病例約占全球一半。食管鱗狀細(xì)胞癌（esophageal squamous cell carcinoma, ESCC）是中國(guó)EC的主要組織學(xué)類型，約占所有EC的90％以上。EC預(yù)后極差，主要是由于EC患者確診時(shí)已發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）與腫瘤侵

2、襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，涉及多個(gè)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路紊亂。TGF-β是一種多功能細(xì)胞因子，能夠誘導(dǎo)多種組織細(xì)胞發(fā)生 EMT。在腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，TGF-β具有雙重功能，腫瘤發(fā)生早期表現(xiàn)為抑制腫瘤功能而晚期階段則表現(xiàn)為促癌功能。晚期腫瘤組織能夠產(chǎn)生大量的TGF-β，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生 EMT，從而促進(jìn)癌細(xì)胞的侵襲及轉(zhuǎn)移。TAGLN2是鈣結(jié)合蛋白 calponin家族成員，與TAGLN具有高度同源性，主要參與構(gòu)成胞內(nèi)應(yīng)力纖維及肌動(dòng)蛋白穩(wěn)定的維系，與細(xì)胞分

3、化、遷移、足體形成、細(xì)胞浸潤(rùn)和胞外基質(zhì)重塑等生物學(xué)過(guò)程密切相關(guān)。TAGLN和TAGLN2表達(dá)異常見(jiàn)于多種腫瘤，我們已發(fā)現(xiàn)ESCC中TAGLN2明顯高表達(dá)，然而TAGLN2在ESCC中高表達(dá)的機(jī)制尚不清楚。研究表明：TGF-β誘導(dǎo)的TANLN或TAGLN2表達(dá)具有細(xì)胞或微環(huán)境依賴性。因此，本研究旨在探討 TGF-β誘導(dǎo)的 ESCC細(xì)胞系EC9706發(fā)生EMT過(guò)程中，TAGLN2表達(dá)變化及生物學(xué)功能。
　　目的：應(yīng)用攜帶TAGLN2特

4、異性沉默序列或無(wú)關(guān)序列的慢病毒載體感染 ESCC細(xì)胞系EC9706，建立EC9706 shTAGLN2及陰性對(duì)照EC9706 shControl亞細(xì)胞系，確定TGF-β與TAGLN2促進(jìn)ESCC惡性演進(jìn)過(guò)程的相關(guān)性，探討TAGLN2在TGF-β信號(hào)傳導(dǎo)通路中的作用，更深入地理解ESCC發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制。
　　方法：⑴ESCC細(xì)胞系EC9706用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基于37℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2/95%空氣培養(yǎng)

5、箱中培養(yǎng)。⑵應(yīng)用攜帶TAGLN2 shRNA或陰性對(duì)照序列的慢病毒上清感染EC9706細(xì)胞，嘌呤霉素篩選建立EC9706 shTAGLN2或陰性對(duì)照的EC9706 shControl亞細(xì)胞系。⑶用不同濃度TGF-β培養(yǎng)細(xì)胞72h，或用40ng/mLTGF-β培養(yǎng)細(xì)胞不同時(shí)間，收集細(xì)胞，提取蛋白質(zhì)，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。⑷Western印跡：12% SDS-PAGE電泳分離上述蛋白質(zhì)，轉(zhuǎn)膜，牛奶封閉，孵育一抗、二抗，ECL顯色曝光。⑸Transw

6、ell小室檢測(cè)細(xì)胞體外遷移和浸潤(rùn)能力：將EC9706 shTAGLN2和EC9706 shControl接種至遷移或侵襲小室中，于37℃培養(yǎng)箱中孵育，結(jié)晶紫染色，顯微鏡下隨機(jī)選擇5個(gè)視野計(jì)數(shù)發(fā)生轉(zhuǎn)移細(xì)胞數(shù)并統(tǒng)計(jì)分析。⑹統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理，組間比較采用t檢驗(yàn)方法，組間計(jì)量資料差異比較采用單因素方差分析和重復(fù)測(cè)量資料檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)取P=0.05。
　　結(jié)果：①用0-80ng/mL的TGF-β刺激EC9706

7、 shControl細(xì)胞72 h，TAGLN2的表達(dá)隨TGF-β濃度增加而逐漸增高，40 ng/mL和80 ng/mL TGF-β誘導(dǎo)的TAGLN2表達(dá)量最大；然而，在EC9706 shTAGLN2細(xì)胞中，5~20ng/mLTGF-β不能誘導(dǎo)TAGLN2的表達(dá)，但40 ng/mL和80 ng/mL TGF-β均能明顯誘導(dǎo)TAGLN2表達(dá)，且在80ng/mL濃度時(shí)最顯著。在濃度效應(yīng)中，TGF-β刺激對(duì)EC9706 shControl和EC

8、9706 shTAGLN2的增殖均沒(méi)有影響（P>0.05）。②用40ng/mLTGF-β培養(yǎng)EC9706 shControl和EC9706 shTAGLN2細(xì)胞，隨40 ng/mL TGF-β刺激時(shí)間延長(zhǎng)，EC9706 shControl中的TAGLN2的表達(dá)逐漸增加，至48 h和72 h表達(dá)最高，48 h和72 h的刺激對(duì)TAGLN2的誘導(dǎo)并無(wú)明顯差異；但72 h的TGF-β刺激誘導(dǎo)EC9706 shTAGLN2中TAGLN2表達(dá)無(wú)明

9、顯增加。在時(shí)間效應(yīng)中，TGF-β刺激對(duì)EC9706 shControl和EC9706 shTAGLN2的增殖均沒(méi)有影響（P>0.05）。③用5～80ng/mL不同濃度的TGF-β刺激EC9706shControl細(xì)胞系，隨著TAGLN2表達(dá)量逐漸增加，間質(zhì)標(biāo)志物如N-cadherin、Vimentin等蛋白質(zhì)表達(dá)明顯升高，上皮標(biāo)志物如E-cadherin表達(dá)明顯降低。TAGLN2沉默能夠抑制TGF-β誘導(dǎo)EC9706 shTAGLN2中

10、間質(zhì)分子標(biāo)志物增加（N-cadherin、Vimentin）和上皮標(biāo)志物（E-cadherin）表達(dá)降低。④TGF-β能顯著增加EC9706 shControl細(xì)胞遷移或浸潤(rùn)的細(xì)胞數(shù)（P＜0.05），但并不能增加EC9706 shTAGLN2細(xì)胞遷移或浸潤(rùn)的細(xì)胞數(shù)量。⑤TGF-β能夠顯著誘導(dǎo)EC9706 shControl中p-Smad2/3激活，TAGLN2的表達(dá)沉默抑制了p-Smad2/3激活及MMP-2的基礎(chǔ)表達(dá)及TGF-β誘導(dǎo)后