sDR5-Fc抑制炎癥反應改善大鼠心肌缺血-再灌注損傷.pdf

1、背景：急性心肌梗死(AMI)是對人類健康造成嚴重危害的心血管急危重癥。臨床治療AMI主要是梗死后在最短的時間內(nèi)進行溶栓（尿激酶、鏈激酶等）和直接經(jīng)皮冠狀動脈腔內(nèi)成形術(PCA)，以減小梗死范圍，挽救因氧氣和能量供應不足而瀕臨死亡的心肌細胞。而在AMI的治療和自然轉歸過程中，常伴發(fā)心肌缺血-再灌注損傷（MI/RI），引起更大范圍的心肌細胞死亡，主要是再灌注加速了嚴重損傷細胞的死亡過程，并伴隨了以炎癥細胞浸潤和炎癥因子產(chǎn)生為特征的強烈的炎癥

2、反應，最終可能導致心肌梗塞、纖維化、心肌肥厚和心力衰竭。近年來研究發(fā)現(xiàn)，炎癥因子表達量的高低和缺血后心臟功能的損害與細胞壞死數(shù)量的多少密切相關，并在其中起了非常重要的作用。眾多基礎實驗結果證實，通過藥物拮抗炎癥反應的發(fā)生發(fā)展可以有效下調(diào)炎癥反應，從而改善缺血-再灌注損傷（I/RI）。在大鼠心肌缺血-再灌注（MI/R）模型中， Fucoidan可以通過抑制炎癥通路的活化，同時減少炎癥介質表達及促炎細胞的浸潤，減輕缺血-再灌注損傷來保護大鼠

3、肝臟；Dongdong Sun等的研究也證明，Luteolin可以抑制MPO及炎癥因子包括IL-6，IL-1α及TNF-α的表達，這些都有益于減少MI/R后心肌梗死面積，提高心功能。
　　課題組經(jīng)過十余年的探索，發(fā)現(xiàn)TRAIL/ DR5與心肌梗死密切相關，前期利用酵母來源的人sDR5阻斷TRAIL/ DR5通路可顯著減少模型大鼠的AMI心肌梗死面積，減輕心肌梗死程度，相關成果已獲批國家發(fā)明專利（專利號：ZL201210442685

4、.6）。此外， TRAIL可與其受體結合而介導炎癥反應。為了延長體內(nèi)半衰期及增加療效，利于蛋白生產(chǎn)及純化，更好的向藥物開發(fā)轉化，我們進一步將sDR5與人IgG1的Fc片段進行融合，形成sDR5-Fc抗體融合蛋白，并構建sDR5-Fc抗體融合蛋白高表達穩(wěn)轉細胞株，在哺乳動物細胞CHO中進行大規(guī)模表達、純化，得到產(chǎn)量高、活性好的sDR5-Fc抗體融合蛋白。并推測，sDR5-Fc蛋白可通過阻斷 TRAIL，并抑制炎癥反應，改善心肌缺血-再灌注

5、引起的炎性損傷，限制心肌梗死面積的擴大從而保護心肌細胞。
　　我們在已有報道和實驗室前期研究基礎上，通過建立心肌缺血-再灌注大鼠模型，檢測sDR5-Fc對心肌梗死面積的影響以及炎癥因子表達、炎癥細胞浸潤和心肌纖維化情況，探討炎癥反應在心肌缺血-再灌注大鼠模型中發(fā)揮的效應及 sDR5-Fc對其的作用，綜合評價人sDR5-Fc蛋白作為新型心肌梗死治療藥物的可行性。為進一步揭示心肌缺血-再灌注損傷機制提供實驗基礎，為有效防治MI/R開辟

6、新思路。
　　目的：建立大鼠心肌缺血-再灌注模型，從大鼠心臟組織的形態(tài)結構、蛋白水平、RNA水平及組織學等方面探討sDR5-Fc對大鼠心肌缺血-再灌注（MI/R）的保護作用及相關炎癥機制。
　　方法：
　　1、建模及取材：我們選擇8周齡的Wistar雄性大鼠，將實驗鼠按照隨機數(shù)字表法分為三組，通過結扎左冠狀動脈前降支使其心肌缺血，并在1h后松開結扎線行再灌注處理，建立大鼠急性心肌缺血-再灌注模型，并對各組大鼠給予相應處

7、理：藥物組（sDR5-Fc，16mg/kg）、磷酸鹽緩沖液組（PBS和假手術（sham）組（只開胸不結扎，其他處理同PBS組）。同時在再灌注后3h、24h及2w時剝離心臟獲取結扎線下方的心臟組織。
　　2、模型及用藥效果鑒定：通過伊文氏藍-2,3,5-氯化三苯基四氮唑（Evans blue-TTC）雙色染色法檢測心肌梗死面積；利用蘇木素-伊紅染色（HE）檢測組織切片中心肌組織的形態(tài)結構；
　　3、模型中炎癥因子表達情況檢測：

8、通過實時定量 PCR（RT-PCR）及免疫印跡法（WB）測定心肌組織中TNF-α、IL-1β、IL-6等炎癥因子的表達；用Quantity One軟件對WB結果進行半定量分析。
　　4、模型中炎癥細胞浸潤情況檢測：通過免疫組織化學法（IHC）檢測心肌中巨噬細胞、T淋巴細胞等炎癥細胞的浸潤情況；
　　5、心功能檢測：通過超聲心動圖檢測心肌缺血1小時-再灌注2周（I1h-R2w）的大鼠心功能；
　　6、心肌纖維化檢測：通過

9、Masson三色染色法檢測心肌缺血1小時-再灌注2周的心肌纖維化情況。
　　結果：
　　1、成功建立急性MI/R大鼠模型。
　　2、HE染色檢測大鼠心肌組織形態(tài)學變化可見 PBS組梗死部位出現(xiàn)心肌細胞排列紊亂，有的細胞出現(xiàn)核破碎，心肌橫紋消失；與PBS組相比較，I/R+sDR5-Fc組梗死區(qū)域的心肌細胞呈梭形排列，較為整齊有序，心肌橫紋明顯。
　　3、RT-PCR檢測心肌組織中炎癥因子mRNA表達水平，結果顯示，

10、PBS組的TNF-α、IL-1β、IL-6表達較Sham組上調(diào)；與PBS組相比，注射sDR5-Fc組大鼠的TNF-α、IL-1β、IL-6表達下調(diào)。
　　4、Western blotting檢測心肌組織中炎癥因子表達，結果顯示，PBS組的TNF-α、IL-1β、IL-6表達較Sham組上調(diào)；與PBS組相比，注射sDR5-Fc組大鼠的TNF-α、IL-1β、IL-6表達下調(diào)；與RT-PCR結果一致。
　　5、免疫組化檢測發(fā)現(xiàn)，

11、PBS組巨噬細胞、T淋巴細胞浸潤比Sham組增多；而sDR5-Fc注射處理組的浸潤量減少。
　　6、心肌缺血-再灌注2周，與Sham組相比，PBS組超聲心動圖顯示有明顯的心肌運動平緩，心電圖顯示有ST段抬高；而sDR5-Fc組ST段恢復平穩(wěn)，心功能較PBS組得到明顯改善。
　　7、心肌缺血-再灌注2周，心肌纖維化，與Sham組相比，PBS組與sDR5-Fc組有明顯的心肌纖維化；用藥sDR5-Fc后心肌纖維化面積比PBS組明顯