奶牛乳腺上皮細(xì)胞系的建立.pdf

1、乳腺上皮細(xì)胞是特化的具有分泌性的功能細(xì)胞，是乳腺行使泌乳功能的細(xì)胞基礎(chǔ)，亦是研究泌乳啟動(dòng)、功能維持、退化等生理過(guò)程中內(nèi)外細(xì)胞因子調(diào)節(jié)、信號(hào)傳導(dǎo)、功能基因的表達(dá)以及乳腺腫瘤的形成、癌變必不可缺少的實(shí)驗(yàn)材料。現(xiàn)有的研究顯示反芻動(dòng)物與人類(lèi)、嚙齒類(lèi)動(dòng)物泌乳調(diào)控機(jī)制存在很大的差異，并且相對(duì)于其它種類(lèi)動(dòng)物而言，反芻動(dòng)物的乳腺調(diào)控機(jī)理還未充分證明，主要原因是泌乳量較大的奶牛乳腺上皮細(xì)胞的培養(yǎng)較為困難。 體外培養(yǎng)的奶牛乳腺上皮細(xì)胞在乳腺生長(zhǎng)發(fā)育

2、和泌乳機(jī)制的研究及乳腺生物反應(yīng)器的應(yīng)用等方面具有重要作用。目前雖然培養(yǎng)的奶牛乳腺上皮細(xì)胞已有一些報(bào)道，但往往未成功地建立起奶牛乳腺上皮細(xì)胞系，不適合作為研究泌乳機(jī)制及檢測(cè)乳腺表達(dá)載體的細(xì)胞模型。奶牛乳腺上皮細(xì)胞系的建立可為轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生產(chǎn)、泌乳量提高等的研究提供良好的動(dòng)物體外模型，具有泌乳功能的乳腺上皮細(xì)胞系亦可為乳腺發(fā)育學(xué)、乳腺病理學(xué)、泌乳生物工程學(xué)研究的細(xì)胞模型，因此，有必要對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞的體外培養(yǎng)技術(shù)和細(xì)胞系建立技術(shù)，激素與乳腺

3、上皮細(xì)胞分泌功能的關(guān)系等方面進(jìn)行深入研究。 本研究選取屠宰場(chǎng)屠宰的泌乳后期的健康荷斯坦奶牛乳腺組織作為實(shí)驗(yàn)材料，利用組織塊接種法成功地獲得了奶牛乳腺上皮細(xì)胞，并利用細(xì)胞角蛋白18的免疫熒光染色對(duì)乳腺上皮細(xì)胞進(jìn)行了鑒定，通過(guò)對(duì)細(xì)胞接種存活率、群體倍增時(shí)間、生長(zhǎng)曲線、形態(tài)學(xué)等生物學(xué)性狀的檢測(cè)，建立并鑒定了正常培養(yǎng)的奶牛乳腺上皮細(xì)胞系。此外，通過(guò)HPLC法對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞中乳糖和酪蛋白進(jìn)行了測(cè)定，反映了激素對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞泌乳功能

4、的影響，從而為奶牛乳腺上皮細(xì)胞生物反應(yīng)器模型的建立和泌乳機(jī)制的研究奠定了良好的基礎(chǔ)。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本研究獲得了純化的奶牛乳腺上皮細(xì)胞，建立并鑒定了奶牛乳腺上皮細(xì)胞系。通過(guò)細(xì)胞傳代，反復(fù)凍存和復(fù)蘇，實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞系的長(zhǎng)期保存，獲得了大量的乳腺上皮細(xì)胞。奶牛乳腺上皮細(xì)胞在添加表皮生長(zhǎng)因子培養(yǎng)液中，生長(zhǎng)增殖性狀良好，細(xì)胞傳到20代以上仍保持旺盛的增殖活力。胰島素培養(yǎng)的細(xì)胞中酪蛋白變化不大，而催乳素和孕酮的細(xì)胞酪蛋白有明顯的升高；對(duì)三種激

5、素作用下細(xì)胞培養(yǎng)液中酪蛋白在不同時(shí)間點(diǎn)含量變化進(jìn)行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)均明顯升高，在24小時(shí)內(nèi)，三種激素升高均最明顯；激素對(duì)細(xì)胞乳糖作用的HPLC結(jié)果發(fā)現(xiàn)，胰島素對(duì)細(xì)胞中乳糖的影響不大，而催乳素和孕酮對(duì)細(xì)胞中的乳糖有明顯的升高作用；對(duì)三種激素的培養(yǎng)液在不同時(shí)間點(diǎn)乳糖含量進(jìn)行了研究發(fā)現(xiàn)，胰島素的培養(yǎng)液中乳糖濃度始終很高，但沒(méi)有什么變化，而催乳素和孕酮的培養(yǎng)液在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)卻沒(méi)有什么明顯的變化，含量較低。同時(shí)對(duì)三種激素在不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)細(xì)胞活力影響的