Ⅰ型糖尿病相關(guān)抗原ChgA的HAL-A-0201限制性表位的合成與鑒定.pdf

1、目的:Ⅰ型糖尿病(Type1 diabetes，T1D)是一種胰島β細(xì)胞被自身反應(yīng)性CD4+和CD8+T細(xì)胞介導(dǎo)破壞后，胰島素分泌絕對(duì)不足而造成的自身免疫性疾病。現(xiàn)已公認(rèn)，在非肥胖性糖尿病(nonobese diabetic，NOD)小鼠和Ⅰ型糖尿病患者中，自身反應(yīng)性CD4+T細(xì)胞和CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)均是發(fā)病中不可缺少的效應(yīng)細(xì)胞。對(duì)胰島β細(xì)胞的自身免疫攻擊進(jìn)行抗原特異性的免疫干

2、預(yù)與阻斷，可以重新建立機(jī)體對(duì)胰島β細(xì)胞自身抗原的免疫耐受，是一種可能從根本上預(yù)防T1D發(fā)生和發(fā)展的理想途徑，故尋找T1D發(fā)病過程中重要的靶標(biāo)抗原以誘導(dǎo)免疫耐受具有重要意義。大多數(shù)胰島β細(xì)胞自身抗原都可以被CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞識(shí)別，如胰島素(insulin)、谷氨酸脫羧酶（glutamic acid decarboxylase，GAD）和胰島特定的葡萄糖-6-磷酸酶催化亞基相關(guān)蛋白(islet-specific glucose-

3、6-phosphatase catalytic subunit-relatedprotein，IGRP)。嗜鉻粒蛋白A(Chromogranin A，ChgA)是近幾年剛被發(fā)現(xiàn)的T1D相關(guān)抗原，它可以被NOD小鼠和人類的CD4+T細(xì)胞識(shí)別，但能否被CD8+T細(xì)胞所識(shí)別還未知。HLA-A*0201是亞洲及高加索人群中的高頻等位基因（HLA-A2超型占有比例為50％），研究發(fā)現(xiàn)該基因與T1D高患病風(fēng)險(xiǎn)有一定相關(guān)性。國外David VS研究小

4、組建立了一個(gè)HLA-A*0201轉(zhuǎn)基因NOD小鼠模型——NOD.β2mnullHHD小鼠，并證實(shí)了該人源化NOD小鼠模型能被用于HLA-A*0201限制性的T1D優(yōu)勢(shì)CD8+T細(xì)胞表位的鑒定，從而解決了實(shí)驗(yàn)研究中胰腺組織樣本極少且很難獲取，外周血中自身反應(yīng)性CD8+T細(xì)胞數(shù)量極少的問題，使關(guān)于T1D患者HLA-A*0201限制性CD8+T細(xì)胞表位鑒定的研究得到了極大的發(fā)展。本研究預(yù)測(cè)并初步合成了HLA-A*0201限制性T1D相關(guān)抗原C

5、hgA的CD8+T細(xì)胞表位肽，對(duì)繼續(xù)深入研究HLA-A2超型表位有較大的參考價(jià)值，對(duì)T1D基于超型表位的耐受誘導(dǎo)治療提供新的候選靶標(biāo)抗原表位具有一定價(jià)值。
　　方法:使用SYFPEITHI、IEDB和NETMHC三個(gè)表位預(yù)測(cè)網(wǎng)站進(jìn)行預(yù)測(cè)，對(duì)預(yù)測(cè)結(jié)果進(jìn)行綜合分析，得到與HLA-A*0201限制性候選表位肽，再應(yīng)用間接熒光標(biāo)記法檢測(cè)候選表位肽與HLA-A*0201的相對(duì)親和力。再進(jìn)行體外細(xì)胞功能試驗(yàn)，通過Elispot Assay檢測(cè)

6、候選表位肽誘導(dǎo)小鼠脾淋巴細(xì)胞IFN-γ表達(dá)的能力，使用[3H] thymidine摻入法檢測(cè)表位肽誘導(dǎo)脾淋巴細(xì)胞增殖的能力，利用以上兩個(gè)實(shí)驗(yàn)對(duì)候選表位肽進(jìn)行初篩;再通過胞內(nèi)因子染色流式細(xì)胞術(shù)分析表位肽特異性CD8+CTL表達(dá)IFN-γ、IL-17的水平判斷其誘導(dǎo)細(xì)胞因子的能力，同上方法檢測(cè)其誘導(dǎo)表達(dá)perforin的水平以判斷細(xì)胞毒作用的大小，并利用HLA-A2抗體阻斷T2抗原提呈，以判定IFN-γ、IL-17和perforin由CD8

7、+CTL表達(dá)。結(jié)果:1.通過分析歸納SYFEPITHI、IEDB和NETMHC三個(gè)在線表位預(yù)測(cè)網(wǎng)站的結(jié)果，預(yù)測(cè)得到HLA-A*0201限制性的四條候選表位肽ChgA10-19、ChgA43-52、ChgA8-16和ChgA75-84。合成后通過HPLC檢測(cè)純度大于95％，通過質(zhì)譜檢測(cè)分子量與理論值吻合。2.通過間接免疫熒光法檢測(cè)四條抗原表位肽與HLA-A*0201分子的相對(duì)親和力，得到各抗原表位肽的相對(duì)熒光強(qiáng)度FI。ChgA10-19和

8、ChgA43-52的相對(duì)熒光強(qiáng)度分別為2.74±0.37、3.56±0.41，高于IGRP206-2140.70±0.07，P＜0.05; ChgA8-16和ChgA75-84的相對(duì)熒光強(qiáng)度為0.83±0.20、0.77±0.04，與IGRP206-214對(duì)比統(tǒng)計(jì)學(xué)無差異，P＞0.05。與HIVpol476-4842.33±0.08對(duì)比，ChgA10-19組無差異，P＞0.05，其他三組有差異，P＜0.05。3.通過[3H]胸腺嘧啶攝取

9、法評(píng)價(jià)候選表位肽刺激脾淋巴細(xì)胞增殖，得到檢測(cè)射線的每分鐘計(jì)數(shù)次數(shù)(cpm)。ChgA10-19和ChgA43-52的CPM分別為7807±524、8166±714，高于medium3116±195，P＜0.05;ChgA8-16和ChgA75-84的CPM為3556±360、3766±334，與medium組對(duì)比統(tǒng)計(jì)學(xué)無差異，P＞0.05。與InA2-10組CPM8931±768對(duì)比，ChgA10-19組和ChgA43-52無差異，P＞

10、0.05，另外兩組組有差異，P＜0.05。4.通過ELISPOT斑點(diǎn)酶聯(lián)免疫分析檢測(cè)四條肽誘導(dǎo)刺激脾淋巴細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ的能力，得到IFN-γ斑點(diǎn)數(shù)。ChgA10-19和ChgA43-52誘導(dǎo)產(chǎn)生的斑點(diǎn)數(shù)分別為71.00±7.81和54.00±4.58，高于medium組23.00±4.00，P＜0.05。ChgA8-16和ChgA75-84誘導(dǎo)產(chǎn)生的斑點(diǎn)數(shù)分別為20.00±1.73和25.67±1.20，與medium組對(duì)比無統(tǒng)計(jì)學(xué)

11、意義，P＞0.05。與InA2-10組80.67±5.81相比，ChgA8-16、ChgA10-19與ChgA43-52與組有差異，P＜0.05，ChgA75-84無差異，P＞0.05。5.配合使用HLA-A*0201分子抗體，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)胞內(nèi)因子染色檢測(cè)CD8+T細(xì)胞IFN-γ、IL-17、perforin的表達(dá)比例(％)。IFN組中，ChgA10-19(-)與ChgA43-52(-)組的比例分別為22.23±5.04和15.13±

12、3.99，高于medium組0.93±0.27，P＜0.05; ChgA10-19(+)與ChgA43-52(+)組的比例分別為0.80±0.58和0.90±0.06，與medium組對(duì)比無差異，P＞0.05。與ChgA10-19(-)相比，ChgA10-19(+)有差異，P＜0.05;與ChgA43-52（-）相比，ChgA43-52(+)有差異，P＜0.05。 IL-17組中，ChgA10-19(-)與ChgA43-52(-)組的比

13、例分別為52.23±7.98和45.13±5.23，高于medium組6.63±0.59,P＜0.05; ChgA10-19(+)與ChgA43-52(+)組的比例分別為6.73±0.12和6.40±0.25,與medium組對(duì)比無差異，P＞0.05。與ChgA10-19(-)相比，ChgA10-19(+)有差異，P＜0.05;與ChgA43-52(-)相比，ChgA43-52(+)有差異，P＜0.05。Perforin組中，ChgA1

14、0-19(-)與ChgA43-52(-)組的比例分別為17.27±2.69和15.13±173,高于medium組3.50±0.49, P＜0.05; ChgA10-19(+)與ChgA43-52(+)組的比例分別為4.63±0.38和0.77±0.09,與medium組對(duì)比無差異，P＞0.05。與ChgA10-19(-)相比，ChgA10-19(+)有差異，P＜0.05;與ChgA43-52(-)相比，ChgA43-52(+)有差異，