睪酮與血管衰老關(guān)系的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、血管衰老是心血管疾病的首要危險(xiǎn)因素。在血管衰老的基礎(chǔ)上，衰老相關(guān)心血管疾病的發(fā)生率和嚴(yán)重程度明顯增加。隨著年齡的增長(zhǎng)，男性雄激素水平逐漸降低。研究表明低睪酮水平與男性心血管疾病高發(fā)密切相關(guān)，并且低睪酮水平與男性血管衰老的表現(xiàn)如頸動(dòng)脈內(nèi)中膜增厚、主動(dòng)脈鈣化、動(dòng)脈粥樣硬化等相關(guān)。睪酮替代治療能夠改善衰老相關(guān)的血管病變，改善多種心血管危險(xiǎn)因素。
　　Gas6是由生長(zhǎng)停滯特異性基因6所編碼的一種分泌型蛋白，隸屬于維生素K依賴(lài)性蛋白家族。G

2、as6通過(guò)與TAM酪氨酸受體家族結(jié)合發(fā)揮生物學(xué)功能，該受體家族包含三個(gè)成員Tyro3、Axl和Mer，其中Tyro3主要分布于腦及中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，Mer僅存在于單核細(xì)胞中，Axl分布廣泛，并且與Gas6的結(jié)合能力最強(qiáng)，介導(dǎo)了Gas6的大部分生物學(xué)功能，因此常被稱(chēng)為Gas6/Axl信號(hào)通路。盡管Gas6/Axl在心血管系統(tǒng)中具有重要作用，并兼具接受雄激素調(diào)控和延緩細(xì)胞衰老的特點(diǎn)，但是Gas6/Axl是否參與睪酮對(duì)血管細(xì)胞衰老的調(diào)節(jié)還不清楚

3、。鑒于A(yíng)ngⅡ在促進(jìn)血管衰老和細(xì)胞衰老過(guò)程中的重要作用，本研究將選用AngⅡ建立VSMCs誘導(dǎo)衰老模型，探討睪酮對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)的VSMCs衰老的影響，及Gas6/Axl通路在睪酮改善VSMCs衰老中的作用。
　　目的：
　　(1)采用AngⅡ建立VSMCs誘導(dǎo)衰老模型，探討睪酮對(duì)VSMCs衰老的保護(hù)作用;
　　(2)探討Gas6/Axl/Akt/FoxO信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在睪酮改善VSMCs衰老過(guò)程中的作用。
　　方法

4、：
　　1 原代小鼠血管平滑肌細(xì)胞提取和培養(yǎng)
　　2 VSMCs誘導(dǎo)衰老模型的建立
　　3 VSMCs誘導(dǎo)衰老模型的鑒定
　　4 β-半乳糖苷酶染色
　　5 Western blot檢測(cè)
　　6 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)
　　7 明膠酶譜檢測(cè)
　　8 siRNA轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)
　　9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　結(jié)果：
　　1 睪酮最適作用濃度和作用時(shí)間的篩選
　　與對(duì)照組

5、相比，睪酮濃度在30和300nM時(shí)能明顯降低衰老相關(guān)p16INK4a和p21Cip1的表達(dá)。與對(duì)照組相比，30 nM睪酮在24、36、48小時(shí)時(shí)能顯著降低p16INK4a和p21Cip1的表達(dá)。因此選擇30 nM，24 h作為睪酮最適作用濃度和時(shí)間用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
　　2 睪酮對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)的VSMCs衰老的影響
　　與對(duì)照組相比，AngⅡ(10-6 M，48 h)能夠顯著增加p16INK4a和p21 Cip1的表達(dá)和β-半乳

6、糖苷酶染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量。與AngⅡ刺激組相比，睪酮能夠顯著降低AngⅡ誘導(dǎo)的p16INK4a和p21Cip1的表達(dá)和β-半乳糖苷酶活性。
　　3 AngⅡ?qū)as6/Axl表達(dá)的影響
　　與對(duì)照組相比，AngⅡ顯著降低VSMCs中Gas6和Axl蛋白表達(dá)和細(xì)胞上清液中Gas6含量。
　　4 睪酮對(duì)Gas6/Axl表達(dá)的影響
　　睪酮能夠濃度和時(shí)間依賴(lài)性促進(jìn)Gas6/Axl的表達(dá)。與對(duì)照組相比，30、300 nM睪

7、酮能夠顯著增加Gas6/Axl的表達(dá)。與對(duì)照組相比，睪酮干預(yù)24、36、48 h能夠顯著增加Gas6/Axl的表達(dá)。
　　5 Gas6中和抗體Axl-Fc對(duì)睪酮改善VSMCs衰老的影響
　　與對(duì)照組相比，Axl-Fc能夠顯著增加p16INK4a和p21Cip1表達(dá)，以及β-半乳糖苷酶染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量。與AngⅡ+睪酮干預(yù)組相比，Axl-Fc能夠明顯阻斷睪酮降低p16INK4a和p21Cip1表達(dá)的作用。
　　6 Axl

8、阻斷劑R428對(duì)睪酮改善VSMCs衰老的影響
　　與對(duì)照組相比，R428能夠顯著增加p16INK4a和p21Cip1表達(dá)，以及β-半乳糖苷酶染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量。與AngⅡ+睪酮干預(yù)組相比，R428能夠明顯阻斷睪酮降低p16INK4a和p21Cip1表達(dá)的作用。
　　7 睪酮減少AngⅡ誘導(dǎo)的膠原Ⅰ/Ⅲ的表達(dá)
　　與對(duì)照組相比，AngⅡ能夠顯著增加膠原Ⅰ和膠原Ⅲ表達(dá)。與AngⅡ刺激組相比，睪酮干預(yù)能夠顯著降低AngⅡ誘導(dǎo)的

9、膠原Ⅰ和膠原Ⅲ表達(dá)。
　　8 Axl-Fc對(duì)睪酮降低膠原Ⅰ/Ⅲ表達(dá)的影響
　　與對(duì)照組相比，Axl-Fc能夠顯著增加膠原Ⅰ和膠原Ⅲ的表達(dá)。與AngⅡ+睪酮干預(yù)組相比，Axl-Fc能夠明顯阻斷睪酮減少膠原Ⅰ和膠原Ⅲ表達(dá)的作用。
　　9 R428對(duì)睪酮降低膠原Ⅰ/Ⅲ表達(dá)的影響
　　與對(duì)照組相比，R428能夠顯著增加膠原Ⅰ和膠原Ⅲ的表達(dá)。與AngⅡ+睪酮干預(yù)組相比，R428能夠明顯阻斷睪酮減少膠原Ⅰ和膠原Ⅲ表達(dá)的作用。

10、
　　10 睪酮對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)的MMP-2表達(dá)和活性的影響
　　與對(duì)照組相比，AngⅡ顯著增加MMP-2表達(dá)和活性。與AngⅡ刺激組相比，睪酮能夠顯著降低AngⅡ誘導(dǎo)的MMP-2表達(dá)和活性。
　　11 Axl-Fc對(duì)睪酮調(diào)節(jié)MMP-2表達(dá)和活性的影響
　　與對(duì)照組相比，Axl-Fc顯著增加MMP-2表達(dá)和活性。與睪酮刺激組相比，Axl-Fc明顯阻斷睪酮降低MMP-2表達(dá)和活性的作用。
　　12 R428對(duì)睪

11、酮調(diào)節(jié)MMP-2表達(dá)和活性的影響
　　與對(duì)照組相比，R428顯著增加MMP-2表達(dá)和活性。與睪酮刺激組相比，R428明顯阻斷睪酮降低MMP-2表達(dá)和活性的作用。
　　與對(duì)照組相比，R428能夠顯著增加MT1-MMP表達(dá)和MT1-MMP/TIMP-2比值，降低TIMP-2表達(dá)。與睪酮刺激組相比，R428能夠明顯阻斷睪酮降低MT1-MMP表達(dá)和MT1-MMP/TIMP-2比值和升高TIMP-2表達(dá)的作用。
　　13 睪酮對(duì)

12、Akt/FoxO信號(hào)通路的影響
　　與對(duì)照組相比，AngⅡ刺激組Akt和FoxO1a磷酸化水平降低。與AngⅡ刺激組相比，睪酮干預(yù)組Akt和FoxO1a磷酸化水平明顯升高。
　　14 Axl-Fc對(duì)睪酮調(diào)節(jié)Akt/FoxO磷酸化水平的影響
　　與對(duì)照組相比，Axl-Fc顯著降低Akt和FoxO1a磷酸化水平。與睪酮刺激組相比，Axl-Fc明顯阻斷睪酮升高Akt和FoxO1a的磷酸化水平的作用。
　　15 R428

13、對(duì)睪酮調(diào)節(jié)Akt/FoxO磷酸化水平的影響
　　與對(duì)照組相比，R428顯著降低Akt和FoxO1a磷酸化水平。與睪酮刺激組相比，R428明顯阻斷睪酮升高Akt和FoxO1a磷酸化水平的作用。
　　16 Akt在睪酮調(diào)節(jié)MMP-2表達(dá)和活性中作用
　　與對(duì)照組相比，LY294002顯著增加MMP-2表達(dá)和活性。與AngⅡ+睪酮組相比，AngⅡ+睪酮+LY294002組MMP-2表達(dá)和活性都顯著升高。
　　與對(duì)照組相

14、比，LY294002顯著增加MT1-MMP表達(dá)和MT1-MMP/TIMP-2比值，降低TIMP-2表達(dá)。與AngⅡ+睪酮組相比，AngⅡ+睪酮+LY294002組MT1-MMP表和MT1-MMP/TIMP-2比值顯著升高，TIMP-2表達(dá)顯著降低。
　　17 FoxO1a-siRNA的轉(zhuǎn)染效率
　　與對(duì)照組相比，F(xiàn)oxO1 a-siRNA干擾組FoxO1a蛋白表達(dá)明顯減低。FoxO1a-siRNA對(duì)FoxO1a蛋白的抑制率達(dá)

15、到70％左右。
　　18 FoxO在睪酮調(diào)節(jié)MMP-2表達(dá)和活性中作用
　　與對(duì)照組相比，F(xiàn)oxO1 a-siRNA干擾組MMP-2表達(dá)和活性均明顯降低。與AngⅡ刺激組相比，AngⅡ+FoxO1a-siRNA干擾組的MMP-2表達(dá)和活性均明顯降低。MMP-2表達(dá)和活性在A(yíng)ngⅡ+FoxO1a-siRNA干擾組、AngⅡ+FoxO1a-siRNA干擾+睪酮干預(yù)組和AngⅡ+睪酮干預(yù)組之間沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　與對(duì)照組相

16、比，F(xiàn)oxO1 a-siRNA干擾組MT1-MMP表達(dá)，MT1-MMP/TIMP-2比值明顯降低，TIMP-2表達(dá)顯著升高。與AngⅡ刺激組相比，AngⅡ+FoxO1 a-siRNA干擾組MT1-MMP表達(dá)，MT1-MMP/TIMP-2比值明顯降低，TIMP-2表達(dá)顯著升高。MT1-MMP和TIMP-2表達(dá)以及MT1-MMP/TIMP-2比值在A(yíng)ngⅡ+FoxO1a-siRNA干擾組、AngⅡ+FoxO1a-siRNA干擾組+睪酮干預(yù)組

17、以及AngⅡ+睪酮干預(yù)組之間沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　19 Akt在睪酮延緩VSMCs衰老中的作用
　　與對(duì)照組相比，PI3K抑制劑LY294002能夠促進(jìn)p16INK4a和p21Cip1表達(dá);與睪酮組相比，睪酮+LY294002組p16INK4a和p21Cip1表達(dá)顯著增加;與AngⅡ+睪酮組相比，AngⅡ+睪酮+LY294002組p16INK4a和p21Cip1表達(dá)顯著增加。與LY294002對(duì)p16INK4a表達(dá)的調(diào)節(jié)作用