急性髓系白血病干細(xì)胞新靶點(diǎn)3A4抗原的生物學(xué)特性研究.pdf

1、目的：
　　研究認(rèn)為白血病患者體內(nèi)存在一群極微量的細(xì)胞群，這些細(xì)胞通常對(duì)化療藥物不敏感，能夠逃逸化學(xué)藥物的殺傷作用;同時(shí)具有一定的自我更新能力使其可以在體內(nèi)維持白血病的生成，從而成為白血病復(fù)發(fā)和耐藥的根源。這群白血病細(xì)胞被稱為白血病干細(xì)胞(Leukemia stem cells，LSCs)。只有有效清除LSCs，才能從根本上治愈白血病。發(fā)現(xiàn)并研究LSCs上特異性表達(dá)的分子抗原，對(duì)LSCs的生物學(xué)特性研究以及白血病治療都具有重要意義

2、。前期實(shí)驗(yàn)初步表明，本實(shí)驗(yàn)室自行研制的3A4單克隆抗體對(duì)急性髓系白血病干細(xì)胞（CD34+CD38-CD123+）具有較強(qiáng)的識(shí)別能力。在此基礎(chǔ)上，我們對(duì)3A4單抗靶向的3A4抗原的生物學(xué)特性進(jìn)行全面和深入的分析，探討3A4抗原作為AML LSCs靶點(diǎn)的可能性，為白血病靶向治療提供新的途徑。本課題進(jìn)行了如下四個(gè)部分內(nèi)容的研究:(1)3A4抗原表達(dá)規(guī)律的分析;(2)3A4抗原表位的研究;(3)3A4抗原相關(guān)干細(xì)胞特性的研究;(4)3A4-高三

3、尖杉酯堿抗體偶聯(lián)物的制備及其靶向殺傷活性檢測(cè)。
　　方法：
　　1.3A4抗原表達(dá)規(guī)律的分析
　　1.1 3A4及相關(guān)抗原在白血病干細(xì)胞及各亞群細(xì)胞上的表達(dá):(1)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)3A4抗原、3A4的相關(guān)同型抗原（CD45RA、CD45和CD45RO）以及干/祖細(xì)胞相關(guān)抗原(CD33、CD44、CD123、CD133、CD19和HLA-DR)在兒童白血病患者骨髓LSCs、正常造血干細(xì)胞(Hematopoietic ste

4、m cells，HSCs)及各亞群細(xì)胞上的表達(dá)情況。其中ALL37例（31例B-ALL，6例T-ALL），AML54例（4例M0-M1，14例M2，5例M3，29例M4-M5，2例M6），CML6例。11例特發(fā)性血小板減少性紫癜(Idiopathic thrombocytopenic purpura，ITP)患者作為對(duì)照。(2)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)3A4抗原及上述抗原在10例AML和10例B-ALL復(fù)發(fā)白血病患者骨髓白血病細(xì)胞上的表達(dá)。(3)

5、細(xì)胞定義:LSCs和HSCs以CD34+CD38-Lin-細(xì)胞群定義，各亞群細(xì)胞分別指CD34-、CD34+CD38+、CD34+CD38-和CD34+CD38-Lin-細(xì)胞。
　　1.2 3A4抗原在多器官正常組織和腫瘤組織的分布情況:通過組織微陣列技術(shù)結(jié)合免疫組化法檢測(cè)3A4抗原在99例多器官正常組織和96例多器官腫瘤組織上的表達(dá)。
　　2.3A4抗原表位的研究
　　2.1 CD45RC各截短型真核表達(dá)載體的構(gòu)建及

6、表達(dá):根據(jù)CD45基因6號(hào)外顯子基因序列(CD45RC)構(gòu)建4個(gè)不同的截短型真核表達(dá)載體，分別命名為pcDNA3.1+/CD45RC-1（包含6號(hào)外顯子前99bp）、pcDNA3.1+/CD45RC-2（包含6號(hào)外顯子后99bp）、pcDNA3.1+/CD45RC-3（包含6號(hào)外顯子前48bp）和pcDNA3.1+/CD45RC-4（包含6號(hào)外顯子后48bp）;將空載體pcDNA3.1+、未截短型pcDNA3.1+/CD45 RC以及構(gòu)

7、建成功的上述4個(gè)截短型真核表達(dá)載體分別經(jīng)轉(zhuǎn)染級(jí)抽提試劑盒抽提質(zhì)粒后，經(jīng)LipofectamineTM2000試劑盒采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將上述質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞;通過RT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染后CHO細(xì)胞目的基因的表達(dá);采用流式細(xì)胞術(shù)和Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染后CHO細(xì)胞膜上的CD45RC各截短體蛋白的表達(dá)情況。
　　2.2 表位肽掃描法測(cè)定3A4抗原表位:根據(jù)CD45基因6號(hào)外顯子編碼的氨基酸序列采用固相合成法合成一條多肽片段

8、(序列為DVPGERSTASTFPTDPVSPL TTTLSLAHHS SAALPARTSN TTITANTSD);采用質(zhì)譜法(Massspectrometry，MS)及高效液相色譜法(High performance liquid chromatography，HPLC)檢測(cè)合成的多肽抗原的正確性及純度;根據(jù)間接酶聯(lián)免疫吸附分析法(Indirect enzyme linked immunosorbent assay，iELISA)分析

9、該抗原多肽與3A4抗體的結(jié)合能力。
　　3.3A4抗原相關(guān)干細(xì)胞特性研究
　　3.1 體外實(shí)驗(yàn)測(cè)定3A4抗原相關(guān)干細(xì)胞特性:間接免疫磁珠法分選3A4陽性和3A4陰性Kasumi細(xì)胞和HL60細(xì)胞;BrdU滲入法標(biāo)記3A4陽性和3A4陰性白血病細(xì)胞的增殖狀態(tài);CCK-8法和AnnexinⅤ-PI染色法檢測(cè)化療藥物作用下3A4陽性和3A4陰性白血病細(xì)胞的增殖狀態(tài)和抗凋亡能力。
　　3.2 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)測(cè)定3A4抗原相關(guān)干細(xì)胞特

10、性:通過3A4抗體封閉自血病細(xì)胞株（KG1a細(xì)胞和Nalm-6細(xì)胞）和人骨髓單個(gè)核細(xì)胞表面的3A4抗原，觀察經(jīng)過3A4抗體封閉和未封閉的兩群細(xì)胞在NOD/SCID小鼠體內(nèi)成瘤能力的差異;通過間接免疫磁珠法分選3A4陽性和3A4陰性的AML患者骨髓單個(gè)核白血病細(xì)胞，比較這兩群細(xì)胞在NOD/SCID小鼠異體移植成瘤能力的差異。
　　4.3A4-HHT抗體偶聯(lián)藥物的制備及靶向殺傷活性檢測(cè):
　　4.1 3A4-HHT抗體偶聯(lián)藥物的

11、制備:異型雙功能交聯(lián)劑（SPDP和SMCC）修飾3A4抗體的半胱氨酸(Cysteine，Cys)富含的巰基（-SH）或賴氨酸(Lysine，Lys)殘基富含的氨基（-NH2）;硫脲法將高三尖杉酯堿（Homoharringtonine，HHT）的末端羥基（-OH）巰基化;修飾后的3A4抗體與巰基化HHT4℃過夜結(jié)合反應(yīng);BCA測(cè)定3A4-HHT偶聯(lián)藥物蛋白濃度;流式細(xì)胞儀測(cè)定3A4-HHT偶聯(lián)藥物的活性。
　　4.2 3A4-HHT

12、抗體偶聯(lián)藥物靶向殺傷活性檢測(cè):采用CCK-8細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)不同濃度(0、1、2、4、8、16、32μg/ml)3A4-HHT抗體偶聯(lián)藥物在不同作用時(shí)間（24h、48h和72h）下對(duì)KG1a細(xì)胞和Nalm-6細(xì)胞的靶向殺傷活性。
　　結(jié)果：
　　1.3A4抗原表達(dá)規(guī)律的分析
　　1.1 3A4及相關(guān)抗原在白血病干細(xì)胞及各亞群細(xì)胞上的表達(dá):(1)3A4抗原在AML LSCs上的表達(dá)水平明顯高于HSCs，中

13、位表達(dá)水平分別為94.8％ vs.21.8％，P＜0.0001;且3A4抗原在54例AML患者的LSCs上均為陽性表達(dá)。(2)3A4抗原在AML和B-ALL復(fù)發(fā)白血病患者的白血病細(xì)胞上具有較強(qiáng)的表達(dá)，中位表達(dá)水平分別為（90.9±4.9）％和（81.7±9.1）％。(3)3A4抗原在各亞型AML LSCs上的表達(dá)水平分別為（92.3±3.3）％[M0-1]、（95.1±1.5）％[M2]、（46.4±13.8）％[M3]、(85.2+4

14、.3)％[M4-5]和（61.2±28.9）％[M6]，以M0-1和M2型白血病上的抗原表達(dá)水平最高。(4)3A4抗原在正常CD34+CD38+細(xì)胞上較其他細(xì)胞亞群(CD34+CD38-和CD34+CD38-Lin-)相對(duì)高表達(dá)，而在AML CD34+CD38+、CD34+CD38-和CD34+CD38-Lin-各細(xì)胞群上的表達(dá)無明顯差異。(5)3A4抗原在AML LSCs和HSCs上的表達(dá)選擇性明顯高于CD33、CD123、CD133

15、、CD44和HLA-DR抗原。
　　1.2 3A4抗原在多器官正常組織和腫瘤組織器官的分布情況:(1)3A4抗原主要在脾臟、扁桃體和胸腺等淋巴組織器官上表達(dá)，在甲狀旁腺、小腸、結(jié)腸、胃等組織上主要限制表達(dá)于淋巴組織處，在重要器官組織（如腦、心、肝、肺、腎、生殖器官）上基本不表達(dá)。(2)3A4抗原主要在腸、脾、甲狀腺、淋巴結(jié)等淋巴組織處發(fā)生的B細(xì)胞性淋巴瘤、B細(xì)胞性細(xì)胞瘤、何杰金氏淋巴瘤和非何杰金氏淋巴瘤上高表達(dá)，在T細(xì)胞性淋巴瘤上

16、基本不表達(dá)。
　　2.3A4抗原表位的研究
　　2.1 CD45RC各截短型真核表達(dá)載體的構(gòu)建及表達(dá):(1)真核表達(dá)載體pcDNA3.1+/CD45RC-1、 pcDNA3.1+/CD45RC-2、 pcDNA3.1+/CD45RC-3和pcDNA3.1+/CD45RC-4經(jīng)搖菌擴(kuò)增提取質(zhì)粒DNA后，酶切及測(cè)序結(jié)果顯示構(gòu)建的載體分別包含相應(yīng)的目的基因片段，表明CD45RC的4個(gè)截短型真核表達(dá)載體構(gòu)建成功。(2) RT-PCR

17、結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染后的各截短型CD45RC CHO細(xì)胞中存在CD45基因表達(dá)，表明各轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞在轉(zhuǎn)錄水平上成功表達(dá)CD45基因，轉(zhuǎn)染后細(xì)胞分別命名為CD45RC-1 CHO、CD45RC-2 CHO、CD45RC-3 CHO和CD45RC-4CHO。(3)流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，4個(gè)截短型CD45RC CHO細(xì)胞均可檢測(cè)到3A4抗原的表達(dá)，表達(dá)水平分別為（36.7±6.9）％、（35.2±13.3）％、（43±7.9）％和（41.4±14.

18、2）％，各組間均無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P值均＞0.05）。而Western blot法在CD45RC-1 CHO、CD45RC-2 CHO、CD45RC-3 CHO和CD45RC-4 CHO細(xì)胞上未能檢測(cè)到3A4抗體識(shí)別的抗原。
　　2.2 表位肽掃描法測(cè)定3A4抗原表位: MS結(jié)果顯示合成的多肽抗原分子量為4996.5，與理論分子量4996.35相近，從分子量水平上提示多肽合成正確;HPLC檢測(cè)結(jié)果顯示，合成的多肽抗原純度為70％左

19、右，符合下一步實(shí)驗(yàn)要求;iELISA結(jié)果顯示，3A4抗體不能識(shí)別CD45基因6號(hào)外顯子編碼的氨基酸線性序列，提示3A4抗原表位可能為構(gòu)象型表位。
　　3.3A4抗原相關(guān)干細(xì)胞特性研究
　　3.1 體外實(shí)驗(yàn)測(cè)定3A4抗原相關(guān)干細(xì)胞特性:3A4陽性Kasumi細(xì)胞和HL60細(xì)胞的增殖能力分別低于相應(yīng)3A4陰性Kasumi細(xì)胞和HL60細(xì)胞的增殖能力，BrdU的表達(dá)水平分別為（4.6±1.9）％ vs.（35.1±1）％，(P＜0

20、.05)和（44.9±1.3）％vs.（74.4±2）％，(P＜0.05);IC50和IC70作用濃度下的THP和Ara-C對(duì)3A4陽性Kasumi細(xì)胞和HL60細(xì)胞的抑制率均低于相應(yīng)3A4陰性細(xì)胞（P值均＜0.05），而IC50和IC70濃度下的HHT對(duì)這兩群細(xì)胞的抑制率均無明顯差異（P值均＞0.05）;在THP和Ara-C作用下，3A4陽性Kasumi細(xì)胞和HL60細(xì)胞的抗凋亡能力均高于相應(yīng)的3A4陰性白血病細(xì)胞，而在HHT作用下兩

21、者的抗凋亡能力無明顯差異。
　　3.2 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)測(cè)定3A4抗原相關(guān)干細(xì)胞特性:經(jīng)尾靜脈注射5×106個(gè)Nalm-6細(xì)胞后，3A4抗體孵育組小鼠和鼠IgG抗體孵育組小鼠在植入15天以后，均開始出現(xiàn)行動(dòng)遲緩，消瘦、后肢癱瘓或弓背等情況，流式和病理結(jié)果顯示小鼠體內(nèi)存在白血病細(xì)胞浸潤，中位發(fā)病時(shí)間分別為18和22天。經(jīng)尾靜脈注射5×106個(gè)KG1a細(xì)胞后，鼠IgG抗體孵育組小鼠均生成白血病，成瘤率為100％(3/3)，中位發(fā)病時(shí)間為58天

22、;3A4抗體孵育組小鼠生存狀態(tài)良好。
　　4.3A4-HHT抗體偶聯(lián)藥物的制備及靶向殺傷活性檢測(cè):BCA測(cè)定3A4-SPDP-HHT和3A4-SMCC-HHT偶聯(lián)物的蛋白濃度分別為0.2mg/ml和0.3mg/ml;流式結(jié)果顯示3A4-SPDP-HHT和3A4-SMCC-HHT對(duì)KG1a細(xì)胞的識(shí)別能力與裸抗3A4無明顯差異，分別為98.89％和94.68％; CCK-8結(jié)果顯示，在不同觀察時(shí)間和藥物濃度作用下，3A4-SPDP-H

23、HT和3A4-SMCC-HHT對(duì)Nalm-6細(xì)胞的抑制率均明顯低于KG1a細(xì)胞（P值均＜0.05），說明3A4-SPDP-HHT和3A4-SMCC-HHT對(duì)靶細(xì)胞KG1a具有良好的選擇性殺傷作用。其中，3A4-SPDP-HHT和3A4-SMCC-HHT隨著作用濃度增加，對(duì)細(xì)胞的抑制作用亦逐漸增強(qiáng)，但不呈時(shí)間依賴性。
　　結(jié)論：
　　1.3A4抗原選擇性地高表達(dá)于AML LSCs，以M0-1和M2類型白血病最為明顯，而在正常H

24、SCs上弱表達(dá)。3A4抗原在AML LSCs和HSCs上的表達(dá)選擇性明顯高于CD33、CD123、CD133和CD44等抗原分子。此外在復(fù)發(fā)AML患者的骨髓白血病幼稚細(xì)胞上同樣具有較強(qiáng)的表達(dá)水平。
　　2.3A4抗原主要在淋巴相關(guān)組織器官及淋巴細(xì)胞上表達(dá)，在重要器官組織（如腦、心、肝、肺、腎和生殖器官等）上基本不表達(dá)。
　　3.3A4抗原表位主要為CD45基因6號(hào)外顯子編碼的蛋白區(qū)域，可能是構(gòu)象型表位。
　　4.3A4