人老化椎間盤(pán)髓核細(xì)胞體外老化模型的建立與細(xì)胞老化表型的初探.pdf

1、目的:
　　構(gòu)建人椎間盤(pán)髓核細(xì)胞(nucleus pulposus cells，NPCs)老化模型，探討老化NPCs中生長(zhǎng)因子的表達(dá)差異及其與椎間盤(pán)退變(intervertebral disc degeneretion，IDD)的關(guān)系。
　　方法:
　　1、體外單層培養(yǎng)人正常NPCs系(ScienCel14800)，連續(xù)1∶2傳代培養(yǎng)，誘導(dǎo)建立NPCs復(fù)制性老化(replication senescence cells

2、，RS)模型;
　　2、不同濃度雙氧水作用于未老化NPCs，模擬椎間盤(pán)氧化應(yīng)激微環(huán)境，誘導(dǎo)建立應(yīng)激誘導(dǎo)過(guò)早老化(stress induced premature senescence cells，SIPS)模型;
　　3、細(xì)胞衰老β-半乳糖苷酶(Senescence-associatedβ-galactosidase，SA-β-gal)染色檢測(cè)NPCs陽(yáng)性表達(dá)率;
　　4、流式細(xì)胞儀檢測(cè)G1期細(xì)胞比例及細(xì)胞凋亡率。CC

3、K-8檢測(cè)不同代次細(xì)胞增殖活性;
　　5、應(yīng)用Agilent表達(dá)譜芯片初步篩選出正常與老化NPCs中差異性表達(dá)的生長(zhǎng)因子;
　　6、實(shí)時(shí)熒光定量PCR進(jìn)一步驗(yàn)證所篩選生長(zhǎng)因子的表達(dá)差異。
　　結(jié)果:
　　1、NPCs經(jīng)連續(xù)傳代、雙氧水誘導(dǎo)可分別構(gòu)建RS模型及SIPS模型;
　　2、兩種老化模型的SA-β-Gal陽(yáng)性表達(dá)的細(xì)胞比例均高于70％，G1期細(xì)胞比例均高于80％，凋亡率均低于10％;
　　3、A

4、gilent表達(dá)譜芯片篩選出的堿性成纖維生長(zhǎng)因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)與血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子a(Vascular endothelial growth factor a，VEGF-a)在不同老化模型中，表達(dá)有顯著性差異(p＜0.05)，特別是bFGF在SIPS模型中的表達(dá)顯著高于RS模型(p＜0.05)。兩種老化模型中的bFGF表達(dá)量顯著高于正常組(p＜0.05)。
　　結(jié)論: