Wnt-β-catenin信號通路及B10細胞對矽肺Th免疫調控機制的研究.pdf

1、目的：
　　本研究利用小鼠矽肺模型，通過氣管灌注β-catenin短發(fā)夾RNA(short hairpinRNA，shRNA)慢病毒載體懸液阻斷肺部的Wnt/β-catenin信號通路或者腹腔注射抗小鼠CD22單克隆抗體消除B10細胞，動態(tài)觀察矽肺進展過程中不同Th細胞亞群的數量及其相關細胞因子的變化，進而闡明矽肺發(fā)病過程中Wnt/β-catenin信號通路和B10細胞對Th免疫的調控作用，為探索矽肺的發(fā)病機制提供新的理論依據。<

2、br>　　方法：
　　一、建立Wnt/β-catenin信號通路阻斷模型和B10消除模型
　　C57BL/6小鼠（6-8周，雌性）按體重隨機分組。非暴露式氣管內灌注3×107TUβ-catenin shRNA慢病毒懸液，干擾小鼠肺部的β-catenin表達，建立Wnt/β-catenin信號通路阻斷模型，使用相同滴度的對照慢病毒建立對照模型;通過腹腔注射300μg anti-CD22 mA特異性消除小鼠體內B10細胞，建立B

3、10消除模型，并使用等體積IgG1同型抗體作為對照。對照組和模型組小鼠分別進行非暴露式氣管內灌注相同體積的生理鹽水和二氧化硅顆粒懸液。將各組小鼠分別于灌注后7、28、56天后處死，收集肺組織、脾組織、肺門淋巴結(hilar lymph node，HLN)、肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)，經過相應的處理后進行實驗測定。
　　二、炎性細胞分類計數
　　將收集的肺泡灌沈液通過300

4、0 rpm低溫離心10 min，獲取細胞并重懸于1 ml磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution，PBS)制備單細胞懸液，取10μl細胞懸液置于細胞計數板上，進行細胞計數。細胞濃度=（四個大格的細胞總數/4）×104。取400μl細胞懸液，低溫3000 rpm離心10 min，棄上清，加入20μl小牛血清混勻，吸取5μl推片，室溫晾干后甲醇固定，待甲醇晾干后使用Wright-Giemsa染液進行雙染，室溫染色10

5、 min后蒸餾水沖洗玻片背面。顯微鏡下計數200個細胞中淋巴細胞，中性粒細胞，巨噬細胞的數量。
　　三、病理切片染色
　　肺組織常規(guī)石蠟切片(5μm)進行蘇木素伊紅(Hematoxyln&Eosin，H&E)染色?？酒?石蠟切片放入烘箱內60℃烘烤2h。脫蠟:將切片在二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ中各浸泡10 min。脫二甲苯:梯度酒精由高濃度至低濃度浸泡各5 min，最后用流水沖洗。細胞核染色:蘇木素染液浸染10 min，流水沖洗。分

6、化:2％鹽酸酒精浸泡20 s至1 min，流水沖洗。返藍:自來水浸泡2h。細胞漿染色:0.5％伊紅染液浸染1至2 min，流水沖洗。脫水:梯度酒精由低濃度至高濃度浸泡各5 min。透明:二甲苯Ⅱ浸泡10 min，換到二甲苯Ⅰ再浸泡10 min。封片:從二甲苯中取出后馬上滴加中性樹膠并使用蓋玻片封片。
　　肺組織常規(guī)石蠟切片（5μm）進行Masson染色?？酒?石蠟切片放入烘箱內60℃烘烤2h。脫蠟:將切片在二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ中各浸

7、泡10 min。脫二甲苯:梯度酒精由高濃度至低濃度浸泡各5 min，最后用流水沖洗。細胞核染色:蘇木素染液浸染10 min，流水沖洗。分化:2％鹽酸酒精浸泡20 s至1 min，流水沖洗。肌纖維染色:麗春紅酸性復紅溶液浸染5 min，0.2％冰醋酸浸洗片刻。分化:1％磷鉬酸溶液浸染5 min。膠原纖維染色:苯胺藍染液浸染5 min，0.2％冰醋酸浸洗片刻。脫水:梯度酒精由低濃度至高濃度浸泡各5 min。透明:二甲苯Ⅱ浸泡10 min，換

8、到二甲苯Ⅰ再浸泡10 min。封片:從二甲苯中取出后馬上滴加中性樹膠并使用蓋玻片封片。
　　四、流式細胞術
　　取脾、肺門淋巴結細胞各1×106加入1 ml含有胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)的1640培養(yǎng)基中，加入2μl刺激劑37℃培養(yǎng)5h后收集細胞，staining buffer清洗兩次，表面染色;staining buffer清洗兩次，固定-破膜液孵育細胞;固定-破膜緩沖液清洗細胞兩次，細胞內染

9、色;staining buffer清洗兩次，加入300μl1％多聚甲醛重懸細胞，FACSCantoⅡ流式細胞儀檢測，Diva軟件進行分析。
　　結果：
　　一、阻斷Wnt/β-catenin信號通路加重矽肺炎癥并減輕纖維化
　　使用慢病毒阻斷Wnt/β-catenin通路后，二氧化硅顆粒誘導的矽肺炎癥明顯加重。早期時間點慢病毒處理組小鼠表現出嚴重的細胞浸潤，同時炎性細胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6大量分泌，顯著

10、高于模型組與對照病毒組;隨著疾病進展，模型組與對照病毒組的炎癥逐漸消退，浸潤的炎性細胞減少，肺泡壁發(fā)生增厚并出現細胞性結節(jié)，而慢病毒處理組在28、56天依然處于炎癥階段，可見明顯的炎性細胞浸潤。同時，由于炎癥持續(xù)存在，纖維化的發(fā)生受到了抑制，56天時慢病毒處理組的膠原沉積明顯較輕。
　　二、阻斷Wnt/β-catenin-號通路可以促進Th17反應
　　早期炎癥階段，慢病毒處理組小鼠Th17反應顯著增強。通過對Th17細胞進

11、行分析，結果顯示早期炎癥階段CD4+T細胞中Th17細胞比例顯著增加，其特異性細胞因子Il17a、Il21 mRNA表達水平也有顯著增高。調控Th17分化增殖的細胞因子中，Il6 mRNA在7天時間點的大量表達是Th17細胞增多的主要原因，而Il23在三個時間點的表達與模型組、對照病毒組相比沒有差異。
　　三、阻斷Wnt/β-catenin信號通路延緩Th1向Th2極化的過程
　　阻斷wnt信號通路后，Th1反應增強，其中T

12、h1細胞占CD4+T細胞的比例在7天、56天都顯著高于模型組和對照病毒組，Th1特異性細胞因子Ifng mRNA在7天也有明顯升高。Th2細胞的特異性核轉錄因子Gata3及其表達的促纖維化因子Il4、Il13 mRNA在56天均明顯低于模型組和對照病毒組。因此，在矽肺的疾病進展過程中，晚期纖維化階段慢病毒處理組Th2反應受到抑制，同時Th1反應仍處于較高水平，使Th1向Th2極化的過程發(fā)生延緩，最終導致纖維化程度減輕。
　　四、阻

13、斷Wnt/β-catenin信號通路通過抑制Tregs調控Th免疫反應
　　流式細胞術結果顯示，慢病毒處理組Tregs在7天顯著減少，通過RealtimeRT-PCR檢測Tregs特異性核轉錄因子顯示，Foxp3 mRNA在7天同樣顯著減少，與Tregs的趨勢相一致。同時，Tregs表達的抑制性細胞因子Tgfb和Il10 mRNA在7、56天均低于模型組和對照病毒組。因此，阻斷Wnt信號通路可以抑制Tregs及其所分泌的細胞因子，

14、引起Tregs介導的免疫抑制能力降低。
　　五、B10細胞參與調控矽肺炎癥纖維化
　　對小鼠進行氣管內灌注二氧化硅懸液后，應用流式細胞術檢測小鼠肺門淋巴結內及脾組織內B10細胞的含量，結果顯示模型組小鼠在7、28、56三個時間點的B10細胞均顯著高于對照組。提示B10細胞參與調控矽肺的炎癥和纖維化。此外，腹腔注射anti-CD22單克隆抗體后，灌注了二氧化硅的小鼠肺門淋巴結和脾組織內的B10細胞含量較模型組顯著減少，證明an

15、ti-CD22單克隆抗體可以有效消除小鼠體內的B10細胞。
　　六、消除B10細胞加重矽肺的炎癥并減輕纖維化
　　病理結果顯示，矽肺小鼠在消除B10細胞后，早期的矽肺炎癥相相較于模型組明顯加重，肺泡滲出液及炎性細胞聚集增多。此外，7天時間點B10細胞消除組小鼠的肺泡灌洗液中細胞總數以及炎性細胞因子TNF-α、IL-6也顯著高于模型組，其中細胞分類計數結果證明B10細胞消除可以誘導淋巴細胞的大量聚集。28天時肺部炎癥逐漸減輕，

16、模型組開始出現小的細胞結節(jié)和肺泡壁增厚，而B10細胞消除的矽肺小鼠未出現細胞結節(jié)，仍處于炎癥階段。56天時小鼠的矽肺炎癥基本消失，模型組小鼠出現較大的細胞性結節(jié)，B10細胞消除組可見小的細胞結節(jié)，肺泡壁增厚相對較輕。Masson染色顯示B10細胞消除組小鼠肺部膠原沉積相對較輕，同時經Realtime PCR測定，促纖維化細胞因子TGF-β mRNA表達量在28、56天均顯著低于模型組。
　　結論：
　　1、阻斷Wnt/β-c