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文檔簡介
1、目的:
糖尿病角膜病變是糖尿病的一種常見并發(fā)癥,可導(dǎo)致糖尿病患者視功能嚴(yán)重減退。糖基化終末產(chǎn)物(AGEs)的累積在糖尿病角膜病變中發(fā)揮重要作用。既往研究認(rèn)為,AGEs可與糖基化終末產(chǎn)物受體(RAGE)結(jié)合,啟動細(xì)胞活性氧(ROS)生成、炎癥反應(yīng)、凋亡,從而促進(jìn)糖尿病角膜病變的發(fā)生發(fā)展。近來研究發(fā)現(xiàn),AGEs的另一受體——糖基化終末產(chǎn)物受體-1(AGER1)在糖尿病患者中受到抑制,提示其可能參與糖尿病及并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展,但其在糖
2、尿病角膜病變中是否具有作用及相關(guān)機(jī)制目前尚無研究。因此,本課題擬以人角膜上皮細(xì)胞(HCEC)及鏈脲佐菌素(STZ)誘導(dǎo)的Ⅰ型糖尿病小鼠為實(shí)驗(yàn)?zāi)P停ㄟ^體內(nèi)外的功能研究探討AGER1在AGEs介導(dǎo)的糖尿病角膜病變中的作用及機(jī)制。
方法:
1.通過免疫組化、免疫熒光、實(shí)時定量PCR(RT-PCR)及Western blot(WB)等方法檢測糖尿病患者、I型(STZ小鼠、INS2Akita/+小鼠)、II型(BKS-db/
3、db)糖尿病小鼠角膜中AGEs及AGER1相關(guān)通路基因的表達(dá)情況,觀察AGER1是否參與糖尿病角膜病變過程。
2.以HCEC為體外細(xì)胞模型,外源加入AGEs-BSA、AGER1干擾RNA及AGER1過表達(dá)質(zhì)粒后,分別以MTT法檢測細(xì)胞增殖能力變化、劃痕法檢測細(xì)胞遷移能力變化、AV/PI法檢測凋亡水平變化、DCFH-DA法檢ROS水平變化、RT-PCR及WB檢測AGER1、依賴NAD+的組蛋白去乙?;福⊿irt1)、RAGE等
4、相關(guān)通路基因的表達(dá)變化,探討AGER1在AGEs介導(dǎo)的糖尿病角膜病變中的具體作用及機(jī)制。
3.以C57BL/6J小鼠為動物模型,結(jié)膜下注射AGEs-BSA,通過小鼠上皮刮除實(shí)驗(yàn)研究AGEs對小鼠角膜上皮刮除后愈合的影響,通過免疫熒光、RT-PCR檢測結(jié)膜下注射AGEs-BSA對AGER1、Sirt1、RAGE等相關(guān)通路基因表達(dá)的影響;以STZ小鼠為糖尿病模型,通過慢病毒轉(zhuǎn)染對角膜組織行AGER1過表達(dá),RT-PCR檢測AGER
5、1過表達(dá)后對AGER1、Sirt1、RAGE等相關(guān)通路基因表達(dá)的影響,探討AGER1過表達(dá)對糖尿病小鼠角膜的作用及分子作用機(jī)制。
結(jié)果:
1.與對照相比,糖尿病患者及STZ、INS2Akita/+、BKS-db/db小鼠角膜組織中都有相對較多的AGEs的積累且主要位于上皮下基底膜,并都表現(xiàn)出AGER1受體表達(dá)顯著減少;STZ及INS2Akita/+、BKS-db/db小鼠角膜組織中RAGE受體表達(dá)顯著增多;STZ及I
6、NS2Akita/+小鼠角膜組織Sirt1表達(dá)顯著減少;STZ小鼠全角膜組織乙?;暮宿D(zhuǎn)錄因子-kB(Acl-NF-kB)表達(dá)顯著升高、促炎的腫瘤壞死因子(TNF-α)(P<0.01)表達(dá)顯著升高、抗凋亡因子B淋巴細(xì)胞瘤-2(Bcl-2)(P<0.01)表達(dá)顯著減少;STZ小鼠角膜上皮促炎因子TNF-α(P<0.01)、白介素-1(IL-1)(P<0.05)及白介素-6(IL-6)(P<0.01)表達(dá)都顯著升高;BKS-db/db小鼠全
7、角膜促炎因子IL-6表達(dá)顯著升高。
2. AGEs-BSA處理HCEC后,細(xì)胞增殖能力(P<0.05)、遷移能力(P<0.05)都顯著降低,ROS生成增多,AGER1受體及Sirt1表達(dá)顯著減少,而RAGE及Acl-NF-kB表達(dá)則顯著增加。通過干擾RNA對AGER1干擾后,HCEC增殖能力顯著降低(P<0.01),ROS生成增多,凋亡增多;分子檢測發(fā)現(xiàn)AGER1干擾使Sirt1蛋白表達(dá)量降低,RAGE受體、Acl-NF-kB
8、表達(dá)量升高,促炎因子IL-1(P<0.01)與促凋亡因子Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)(P<0.05)顯著升高。 AGER1過表達(dá)后RAGE(P<0.01)、Acl-NF-kB表達(dá)受到顯著抑制,而Sirt1蛋白表達(dá)變化不著,促炎與促凋亡因子TNF-α、IL-1、IL-6、Bax表達(dá)均顯著降低(P均<0.01)。
3. STZ小鼠角膜上皮刮除2.5mm后24h、36h角膜上皮缺損率較C57BL/6J對照組顯著升高(P均<0.05
9、);結(jié)膜下注射AGEs-BSA后12h、24h、36h C57BL/6J小鼠角膜上皮愈合均顯著延遲(P均<0.05),且在mRNA水平上AGER1(P<0.01)、Sirt1(P<0.01)、Bcl-2(P<0.01)表達(dá)顯著減少,RAGE(P<0.05)、IL-1(P<0.01)、IL-6(P<0.01)、Bax(P<0.05)表達(dá)顯著升高,而Acl-NF-kB蛋白表達(dá)增加。AGER1過表達(dá)使體外培養(yǎng)的STZ小鼠角膜組織中促炎因子TN
10、F-α(P<0.05)及促凋亡因子Bax(P<0.01)表達(dá)顯著降低。
結(jié)論:
1.Ⅱ型糖尿病患者及糖尿病模型小鼠角膜中均存在 AGEs累積,且 AGER1受體表達(dá)降低、RAGE受體表達(dá)升高。外源性AGEs可使小鼠角膜上皮修復(fù)顯著延遲。
2.糖尿病模型小鼠促炎癥、凋亡基因表達(dá)增加,提示炎癥與凋亡可能參與糖尿病角膜病變的發(fā)病機(jī)制。
3. AGEs能夠顯著抑制HCEC的增殖、遷移,并促進(jìn)HCEC細(xì)胞R
11、OS產(chǎn)生,在體內(nèi)、體外促進(jìn)炎癥、凋亡發(fā)生,在體內(nèi)通過AGER1/Sirt1、RAGE/Acl-NF-kB兩條受體通路發(fā)揮作用。
4. AGER1干擾可使 RAGE表達(dá)上升,加重 AGEs對 HCEC的不良影響;而AGER1過表達(dá)則使RAGE表達(dá)下降,減輕這些作用。保護(hù)性受體AGER1與損傷性受體RAGE可能存在與AGEs的競爭性結(jié)合,兩受體通路有相互拮抗的作用。
5. AGER1受體在糖尿病角膜病變中起保護(hù)性作用,且
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